第八节基因工程跟体外表达.docVIP

中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 医学分子生物学授课内容: 基因工程与体外表达授课对象：医学七年制 、八年制 授课时数： 6学时授课教师： 曾海涛授课地点： 授课时间： 授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材） 胡维新主编，北京：科学出版社，2007， 第一版 第八章 基因工程与体外表达 一、目的要求： 掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。 熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。 了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。 二、讲授重点： 基因克隆的基本过程。 三、讲授难点： α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。 四、教学方法：多媒体教学 五、教 具：多媒体课件 六、讲授内容： 第一节 基因工程中的工具酶 ?一、限制性核酸内切酶（restriction enzyme） 限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。 1．限制性核酸内切酶的分类 Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用。这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1 000bp处切割DNA。 Ⅱ型酶 能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。 2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 3．限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（sticky end）。 如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端. PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端. 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ. 二、其他常用的工具酶 1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I) 有聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。 2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 有5ˊ→3ˊ聚合酶活性, 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性, 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。 (2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。 (3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。 3. 逆转录酶（reverse transcriptase） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成时需要四种脱氧核苷酸及3ˊ-OH引物，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。广泛用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。 5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。 6. 末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 第二节 基因克隆的载体 外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果将其直接导入宿主细胞，没有有效的方法将导入了外源DNA片段的细胞和没有导入外源DNA的细胞区分开来。此外，外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细胞的繁殖而复制，即没有自主复制能力，达不到使外源DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，就需要有一个能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的载体(vector)来携带。外源D