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一、聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）：是一种体外酶促扩增特定DNA片段的技术，即将微量的DNA进行成倍扩增。 （一）原理： 建立在DNA复制原理基础上的一种技术。 （二）典型的PCR包括许多循环，每个循环包括三个步骤： （1）高温变性模板使之成为单链，95度约1min； （2）低温使引物与单链模板退火（复性）55度左右； （3）中温使引物沿模板延伸，75度左右。 经n次（25-30次）循环后，反应混合物中所含目的DNA片段（双链）的拷贝数理论上最高值为2n。但是，在第三轮循环后，才会出现目的DNA片段。 思 考 题 扩增片断的长度的是如何决定的？ 若以N 表示扩增循环数，当一条双链模板循环扩增30次时，反应体系中总分子数多少？非目的产物多少？目的产物多少？ 若用一条引物能否实现大量扩增？ （三）PCR反应体系： 反应缓冲液（10×PCR Buffer） 脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix） 耐热DNA聚合酶（Taq酶，可耐受95度左右高温） 寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2，约20个核苷酸，与目的DNA两侧的区域互补） 靶序列（DNA模板）五部分组成。 1. 耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶的特点 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。 1) 具有5’-3’聚合酶活性和5’－ 3’核酸外切酶活性 2) 最适反应温度为80℃ 3) 最适pH8.0和最佳反缓冲液 Tris·HCl 4) 最佳二价阳离子Mg2+ ，其浓度取决于dNTP浓度（2 mM） 5) 具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有约50%的酶活 核苷酸错误掺入的几率比较高 Tth DNA 聚合酶的特点： 从喜温性真菌中分离获得 1) 具有强的5’-3’聚合酶活性，缺3’-5’核酸外切酶活性。 2) 反应pH值为9，最适温度为75度。 3) 在Mn2+存在时，具有很强的反转录酶活性。 4) 当系统同时存在Mg2+时，反转录产生的cDNA在这种酶的作用下还可以进行PCR扩增。 故可用于RT-PCR。 Pwo DNA聚合酶 从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的Pwo DNA聚合酶是在E.coli中表达后提取的产物。 1) 具有强的5’-3’聚合酶活性，兼有3’-5’外切酶活性。 2) 具有高的耐热性，100度下2小时后仍有一半的活性。 3) 可扩增5kb的片段，扩增DNA的准确度比Taq DNA聚合酶高约10倍。 4) 且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。 C.therm.聚合酶 1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在RT-PCR系统中催化逆转录反应。 2) 具有3’-5’外切酶活性，合成cDNA准确度比Tth DNA聚合酶高约2倍。 2.模板： PCR扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总DNA，也可以是mRNA反转录后形成的cDNA。 DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量； 3. PCR引物： PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。 引物的设计： 1. 引物长度：一般20bp左右。 2. 引物的碱基组成：一般G+C占50-60%，尽量避免数个连续排列的嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3’端；引物本身避免有回文序列。 3. 酶切位点的设计：PCR扩增中，对引物5’端碱基的要求较低，可在引物的5’端加上特殊序列，如限制性酶切位点。 4. 复性的温度：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变性温度（Tm）5度。Tm=（G+C）X4＋（A+T）X2。复性温度通常在55-72度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。 4. dNTPs： 是dATP、dCTP、dGTP、dTTP的总称，储存液pH7.0，浓度一般为2mM，分装后－20度冻存。典型的PCR扩增体系中，dNTPs的终浓度为20-200uM。 5. Mg2+浓度： Mg2+浓度太低会无PCR产物，太高会导致非特异产物的合成。通常情况下，反应体系中有0.5-2.5mM游离Mg2+。 6. PCR系统中的其他成分： PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50m