基于HK―2细胞泽泻萜类组分体外肾毒性评价及其诱导细胞凋亡作用探究.docVIP

基于HK―2细胞泽泻萜类组分体外肾毒性评价及其诱导细胞凋亡作用探究 　　[摘要]用人肾小管上皮细胞（HK-2）评价泽泻萜类组分的肾毒性作用，同时探究其诱导HK-2细胞凋亡的作用，为存在争议的泽泻肾毒性研究提供参考。采用肾小管上皮细胞株，运用 MTT 比色法测定细胞活力，流式细胞术分析细胞凋亡，同时用Western blot检测HK-2细胞 caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin，TFF-3蛋白表达水平，最后用q-PCR检测caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Kim-1，clusterin，TFF-3 mRNA的表达。流式细胞仪检测结果表明，泽泻萜类组分（6.25×10-5，3.125×10-5，1.562 5×10-5 g?mL-1）给药组细胞凋亡率分别为（37.48±1.76）%，（26.91±1.91）%，（25.61±2.05）%。同时，Western blot结果说明泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有显著地降低，而caspase-3蛋白水平显著地提高。q-PCR结果与Western blot结果一致，泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl的 mRNA水平都有显著的降低，而caspase-3 mRNA水平有显著的提高。Western blot和q-PCR结果说明，泽泻萜类组分不同剂量给药组中细胞的clustrein，Kim-1和TFF-3蛋白表达和mRNA水平均有显著地提高。HK-2细胞系体外评价结果表明，泽泻萜类组分具有肾毒性作用，但是还需要进一步的研究证明，同时可诱导HK-2细胞凋亡，为泽泻肾毒性研究以及临床用药安全提供依据。 　　[关键词]泽泻萜类组分；HK-2细胞；细胞凋亡；肾毒性 　　泽泻为泽泻科多年生沼泽草本植物泽泻Alisma orientalis （Sam.） Juzep.的干燥块茎。块茎呈球形、椭圆形或卵形，表面黄白色或淡黄棕色，质坚实。泽泻是临床常用的一味中药，具有利尿、抗肾炎活性、降血糖血脂及抗动脉粥样硬化、抗肾结石形成、抗脂肪肝、对心血管系统及免疫调节等作用[1-4]。近年来，泽泻毒性报道越来越多，尤其以肾毒性为主，泽泻是否具有肾毒性一直存在争议，因此泽泻是否具有肾毒性还需要进一步的探索研究。 　　随着“马兜铃酸肾病”的出现，中草药肾毒性以及肾病逐渐受到国内外学者及医家的强烈关注，已成为医学界的争论焦点之一[5]。因此，中药及中药制剂的安全性日益引起人们的关注。泽泻在临床上有广泛的应用，通常认为泽泻是没有毒性的。研究者用富含三萜类的泽泻提取物喂养大鼠90 d，实验表明高剂量的泽泻提取物对大鼠没有明显的毒副作用[6]。但《中草药不良反应及防治》记录：泽泻“大剂量或长期应用，可致水电解质失衡以及血尿，甚至发生酸中毒”[7]。有研究表明，泽泻醇B对SK-OV3，B16-F10和HT1080肿瘤细胞有明显的毒性[8]。韩国研究者通过23-乙酰泽泻醇B合成泽泻中的其他三萜类化合物，提示这些化合物对B16-F10和HT1080肿瘤细胞也有明显的毒性[9]。同时，有研究认为长时间高剂量的使用泽泻会导致肝毒性或肾毒性[10]。 　　本实验针对前期泽泻肾毒性研究的争议，用HK-2细胞对泽泻萜类组分肾毒性作用进行体外评价，同时探索泽泻萜类组分诱导HK-2细胞凋亡作用，以期为泽泻肾毒性研究以及安全使用提供参考。 　　1材料 　　泽泻饮片（安徽井泉集团中药饮片有限公司，批，药材经南京中医药大学吴启南教授鉴定为对应种属药材。泽泻萜类组分（本实验室制备） 。DMEM高糖-F12（1∶1）不完全培养基购自南京凯基生物发展公司；胰蛋白酶，MTT[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]购自美国Sigma公司，MTT配制质量浓度为5 g?L-1，-20 ℃冰箱保存；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；AB-8大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；甲醇（色谱纯）和二甲基亚砜（DMSO）购自南京化学试剂有限公司。羊抗小鼠 IgG，羊抗兔 IgG，兔抗羊 IgG，考马斯亮蓝染色法检测蛋白试剂盒，TaKaRa反转录试剂盒和TaKaRa试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。 　　CO2培养箱（Thermo Electrom 公司）；生物安全柜（Labconco Purifier Class Ⅱ Biosafety Cabinet）；LDZX-50KB立式压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Anke TDL-40B型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-60数显恒温搅拌循环水浴锅（国华电器有限责任公司）；微量移