基因工程 第四章-12-16课时幻灯片.pptVIP

4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 4.2.8 通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 4.2.8 通过作图标出一个DNA分子上的限制性酶切位点 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.1 DNA连接酶的作用模式 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 5 G CTTAA 5 5 AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 4.3 连接-将DNA连接在一起 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.2 黏末端可增加连接的效率 一般情况下，平末端只有黏末端连接效率的1/10-1/100。 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.2 黏末端可增加连接的效率 如何提高平末端的连接效率 （1）提高DNA分子的浓度，增加末端接触的机会 （2） 例如，载体具有黏末端，DNA分子具有平末端，采取如下方法： 4.3.3 黏末端可增加连接的效率 DNA接头 （linker） 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.2 黏末端可增加连接的效率 寡核苷酸接头 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.2 黏末端可增加连接的效率 寡核苷酸接头 4.3 连接-将DNA连接在一起 4.3.2 黏末端可增加连接的效率 通过附加同聚物反应产生黏末端 4.3 连接-将DNA连接在一起 平头末端的连接： 不同粘性末端的连接： 4.3 连接-将DNA连接在一起 普通连接反应的设计： 总体系 10ul 10×buffer 1ul Vector (3k;500ng/ul) 1ul DNA fragment(500bp;50ng/ul) 3ul Ligase 0.5-1ul H2O2 加水至10ul 反应在16度过夜 * * 4.1 DNA操作酶的范围 4.1 DNA操作酶的范围 4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶 （2）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase） 多核苷酸激酶： 在DNA分子5‘游离末端添加磷酸基团 （活性正好和碱性磷酸酶相反） 4.1 DNA操作酶的范围 4.1.4 修饰酶：去除或添加化学基团的酶 （3）末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶： 在DNA分子3‘末端添加一个或多个脱氧核苷酸 构建人工粘性末端，不需要模板 4.1 DNA操作酶的范围 4.1.5 拓扑异构酶：向共价闭合环状DNA中引入或消除双螺旋的酶 限制性内切酶的发现和功能 限制性内切酶II在特定的核苷酸序列处切割DNA DNA分子中识别序列的出现频率 在实验室条件下进行限制性酶切 对限制性内切酶的酶切结果进行分析 DNA分子大小的估计 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点 平末端和黏末端 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 准确 可重复 4.2.1 限制性内切酶的发现和功能 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 20世纪50年代 宿主调控性限制 4.2.1 限制性内切酶的发现和功能 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 Werner Arber 理论预见限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 4.2.1 限制性内切酶的发现和功能 4.2 切割DNA的酶-限制性内切酶 目前为止，在细菌中已经发现了1200多种限制性内切酶，分为三类： 其识别位点与切割位点相距1000-5000bp，切割位点不表现严格的特异性；2