荧光分光光度测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量(杨丹丹41207106).docVIP

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中 维生素B2的含量 一、实验目的: 1.学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理； 2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。 二、实验原理: 1.维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 2.荧光分光光度计 (1)常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度IF与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。(知识补充如下：) (2)荧光分析仪 显示记录器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器构成，如下图所示：激发光源单色器 显示记录器 激发光源 单色器 液槽 检测器 三、试剂与仪器: F-7000荧光光度计 5 ml吸量管2只，50 ml容量瓶7只, 100 ml容量瓶1只； 10.0μg/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样。 四、实验步骤: （一）F-7000荧光光度计基本操作： 1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min。 2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：设置激发波长为442nm，发射波长为522 nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。 （二）样品测定 1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定 ? ? 在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 2.未知试样的测定 称取0.15-0.2g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转50ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。 3.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 五、数据处理: 1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线： 2.未知样品浓度的测定???????????????? 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 多维葡萄糖粉的质量：0.1874克 维生素B2百分含量 =0.20(ug/ml)/{(0.1874*1000000/50)(ug/ml)} =0.000053=0.0053％ 六、注意事项: 1.使用F-7000荧光光度计时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作； 2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住侧棱。 七、思考题: 1.试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因? 答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高。 2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。