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生活饮用水微生物指标检验 ***疾病预防控制中心 yxf 生活饮用水中微生物指标 微生物指标常规检验流程 实验前准备 1、灭菌吸管 10mL、1mL刻度吸管分别包好，160℃干烤2h灭菌 2、9mL灭菌生理盐水 3、相应的灭菌培养基 4、检验前 ，无菌室用紫外线灯照射30min 菌落总数 定义： 是指水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数 。 培养基： 营养琼脂 设备： 放大镜/菌落计数器 菌落总数平板计数法 总大肠菌群 检测方法 多管发酵法 滤膜法 酶底物法 多管发酵法 定义： 总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 培养基： 乳糖蛋白胨培养液 二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 伊红美蓝培养基 设备： 显微镜 15管法检测步骤 滤膜法 定义： 是指用孔径为0.45μｍ的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在选择性品红亚硫酸钠培养基上37℃培养24h，能形成紫红或红色有金属光泽的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 培养基 品红亚硫酸钠培养基 乳糖蛋白胨培养液 设备： 显微镜，过滤设备 检测步骤 过滤水样：过滤设备 显色培养，染色镜检：24h 复发酵：阳性接种，24h 酶底物法 Enzyme Substrate Test 常用的色原和荧光底物 色原（荧光）糖苷结合物 糖苷酶 色原（荧光）氨基酸结合物 氨基肽酶 常用呈色的色原有：α、β萘酚，邻位或对位硝基酚，对硝基苯胺，酚酞，2-氨4-硝基苯等，如ONPG(邻硝基酚-B-D半乳糖苷 )　 常用的荧光物有：4-甲基伞形酮（4MU），7氨基4甲基伞形酮香豆素 如MUG(四甲基伞形酮-B-D-葡萄糖苷 ) 总大肠菌群酶底物法 定义： 在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养基呈黄色的细菌群组 。 培养基： MMO-MUG培养基 设备： 压膜机 检测步骤 加样：干粉培养基加入到100mL水样中 压膜：专用压膜机分装 培养：36±1℃的培养24h 结果判读： 24h培养后颜色变成黄色判断为阳性反应； 培养24h后判读，为可疑阳性，可延长培养到28h判读，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果 。 耐热大肠菌群 检测方法 多管发酵法 滤膜法 多管发酵法 定义： 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。 培养基： EC培养基 伊红美蓝琼脂 设备： 无特殊设备 检测步骤 初发酵（同总大肠菌群），24h 耐热培养：阳性管接种，24h 显色培养：阳性管接种，24h 滤膜法 定义： 用孔径为0.45μｍ的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，44.5℃培养24h能形成蓝色菌落的细菌为耐热大肠菌群。 培养基： MFC培养基 EC培养基 设备： 过滤设备 大肠埃希氏菌 检测方法 多管发酵法 滤膜法 酶底物法 多管发酵法 定义： 指多管发酵法总大肠菌群阳性，在EC-MUG培养基上44.5℃培养24±2h产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）并产生荧光产物，使培养基在波长366nm紫外光下产生蓝色荧光的细菌。 培养基： EC-MUG培养基 设备： 紫外灯：波长366nm 检测步骤 初发酵（同总大肠菌群），24h 耐热显色培养：阳性管接种，24h 荧光观测，报告 生活饮用水非常规检测项目 贾第虫和隐孢子虫 检测方法: 水样过滤---洗涤离心---免疫磁珠分离---荧光标记和DAPI染色---显微镜检查记述---结果报告 在2012年成为常规检验项目 微生物指标检验方法的总结 总大肠菌群三种方法比较 大肠埃希氏菌三种方法比较 大肠埃希氏菌酶底物法检测示意图 * * 肠道原虫 1 个/10 L 隐孢子虫 肠道原虫 1 个/10 L 贾第鞭毛虫 一般性污染 100 CFU/mL 菌落总数 指示粪便污染 不得检出 MPN/100mL或 CFU/100mL 大肠埃希氏菌 指示粪便污染 不得检出 MPN/100mL或 CFU/100mL 耐热大肠菌群 一般性污染 不得检出 MPN/100mL或 CFU/100mL 总大肠菌群 说明 限值 单位 项目 水样 总大肠菌群