中国中性粒细胞mpo完全缺陷家系的分子机制分析-molecular mechanism analysis of chinese neutrophil mpo completely deficient families.docxVIP

PAGE PAGE 1 中国中性粒细胞 MPO 完全缺陷家系的分子机制研究 摘要 【目的】 通过对 1 个中性粒细胞髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)完全缺陷家系 进行系统的分子遗传学研究，阐明中国 MPO 完全缺陷家系的分子遗传学特征和 MPO 分子遗传改变对其生理学、病理学作用的影响水平及其分子机制。为进一 步开展 MPO 生物合成机制及其生理和病理学研究提供有力的试验材料支持。 【方法】 1. 收集家系血液样本，分离中性粒细胞，并抽提基因组。设计引物扩增 MPO 基因转录调控区和 12 个外显子区，分段扩增 MPO 基因。比较分析家系样本与 正常对照间基因序列差异，绘制家系图。 2. 对中性粒细胞内 MPO 进行活性检测、MPO 细胞化学染色以及通过荧光显 微镜观察 MPO 荧光抗体与 MPO 的杂交信号，从而分析 MPO 缺陷中性粒细胞内 MPO 的氧化活性、表达水平以及定位情况。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS）分离中性粒细胞匀浆样本， 利用 MPO 抗体通过 Western-Blot 分析中性粒细胞中 MPO 的存在情况。 3. 分别提取放线菌酮（Cycloheximide, CHX）处理前后中性粒细胞总 RNA， 利用 real-time RT PCR 技术检测 MPO mRNA 相对正常对照的表达水平，研究此 突变分子机制。 【结果】 1. 通过对家系基因组序列分析，发现患者MPO基因11号外显子第1805个碱基 由G突变为A（TGG TAG），提前产生终止密码子，为W602X纯合子；而其家 庭成员中患者母亲及儿子均为W602X杂合子，此位点为G/A。家系图谱提示此缺 陷为常染色体隐性遗传。 2. 患者中性粒细胞中 MPO 活性不到正常对照总量的 5%、MPO 化学染色完全 阴性、荧光显微镜显示 MPO 荧光染色阴性、Western-Blot 显示患者 MPO 完全缺 陷，而正常对照染色阳性明显。患者女儿与儿子以上结果均接近正常对照一半。 3. Real-time RT PCR 显示患者中性粒细胞 MPO mRNA 表达水平不到正常对 照 1%，而中性粒细胞经 CHX 处理后 MPO mRNA 表达水平明显增高。提示中性 粒细胞内 MPO mRNA 存在降解，而此降解和无义突变介导的 mRNA 降解 （nonsense-mediated mRNA decay, NMD)密切相关。 【结论】 本实验发现MPO完全缺陷患者一例，缺陷为11号外显子第1805位碱基G突变 为A（TGG TAG）所致(NG_009629.1 :c.1805GA)，即W602X纯合子突变。这 一突变导致提前产生终止密码子（premature termination codon, PTC)，继而激活 NMD使产生PTC的MPO mRNA降解，使MPO转录异常而导致完全缺陷。 【关键词】中性粒细胞，髓过氧化物酶，分子机制，完全缺陷 Molecular mechanism research of Chinese patient with myeloperoxidase complete deficiency in neutrophils [Objective] Abstract Through systematic molecular genetics research, we try to clarify the molecular genetics characteristic and the molecular mechanism of this complete myeloperoxidase deficient family. In addition, we also expounded how the molecular genetics change of myeloperoxidase will influences its physiological and pathological function. All of these researches offer a powerfully experimental material for further research of myeloperoxidase in physiology, pathology and synthetic mechanisms. [Methods] Blood samples of the complete deficient family were collected, then ne