柱状黄杆菌flavobacterium columnare)菌蜕疫苗的研究-study on the vaccine of flavobacterium columnaris fungus slough.docx

山东师范大学 山东师范大学 博士学位论文 目 录 中文摘要I 英文摘要 V 符号与缩略词表IX 文献综述 第一章 鱼类柱形病与柱状黄杆菌1 1 柱形病与病原1 2 柱状黄杆菌的命名2 3 柱状黄杆菌的生物学特性2 3.1 分离与培养2 3.2 诊断与鉴定3 3.3 宿主与血清型4 3.4 病原性与感染5 4 柱状黄杆菌的遗传多样性6 5 柱形病的预防对策8 5.1 化学药物或消毒剂防治8 5.2 抗生素防治9 5.3 生态防治和抗病育种 9 5.4 疫苗免疫防治10 第二章 细菌菌蜕平台系统的研究进展13 1 细菌菌蜕的形成机制13 1.1 噬菌体 PhiX174 E 蛋白的裂解功能 13 1.2 特异性跨膜孔道的形成过程15 1.3 裂解基因 E 的限制性表达 17 2 菌蜕生产的质量监控18 3 细菌菌蜕的应用 19 3.1 菌蜕作为疫苗19 3.2 菌蜕作为递呈异源抗原的载体21 i 3.3 菌蜕作为 DNA 疫苗和药物的递送载体 23 4 鱼类致病菌菌蜕的研究24 4.1 迟缓爱德华菌菌蜕25 4.2 嗜水气单胞菌菌蜕25 4.3 鳗弧菌菌蜕26 5 展望 26 实验研究 第三章 柱状黄杆菌的生物学特性研究27 1 材料和方法28 1.1 菌株28 F. columnare G4R3 的复苏与培养 28 F. columnare G4R3 菌落与菌体特征观察 29 F. columnare G4R3 常规生化鉴定 30 F. columnare G4R3 生长曲线的测定 31 1.6 F. columnare G4R3 对抗生素药物的敏感性 32 1.7 16S rDNA 的 PCR 扩增鉴定 33 1.8 半致死浓度 LD50 的测定与草鱼人工感染试验 37 2 结果39 2.1 F. columnare G4R3 的形态特征 39 2.2 常规生化特征40 2.3 生长曲线的建立41 2.4 对抗生素的敏感性42 2.5 16S rDNA 的分子鉴定 44 2.6 对草鱼腹腔注射半致死浓度 LD50 的测定 46 2.7 菌株 F. columnare G4R3 对草鱼的致病作用 47 3 讨论49 第四章 柱状黄杆菌裂解质粒的构建……53 1 材料与仪器54 1.1 菌株和质粒54 1.2 主要实验仪器54 ii 1.3 试剂盒与工具酶55 1.4 相关试剂55 2 实验方法56 2.1 质粒 pMD18T-geneE 的构建 56 2.2 温控裂解质粒 pBV-geneE 的构建 59 温控裂解质粒 pBV-geneE-cat 的构建 61 温控裂解质粒 pBV-geneE-Fpro-cat 的构建 64 geneE 融合蛋白表达质粒 pET28a-geneE 的构建 69 geneE 融合蛋白表达质粒 pET32a-geneE 的构建 71 geneE 融合蛋白表达质粒 pET28a-geneE-cat 的构建 71 geneE 融合蛋白表达质粒 pET32a-geneE-cat 的构建 72 3 实验结果72 3.1 质粒 pMD18T-geneE 的构建 72 3.2 温控裂解质粒 pBV-geneE 的构建 75 温控裂解质粒 pBV-geneE-cat 的构建 77 温控裂解质粒 pBV-geneE-Fpro-cat 的构建 82 geneE 融合蛋白表达质粒 pET28a-geneE，pET32a-geneE 的构建 88 geneE 融合蛋白表达质粒 pET28a-geneE-cat，pET32a-geneE-cat 的构建 89 4 讨论94 第五章 柱状黄杆菌限制性遗传屏障与内源性质粒98 1 材料与方法98 1.1 菌株、质粒与主要试剂99 F. columnare G4R3 基因组 DNA 的提取 99 F. columnare G4R3 的 DNA 核酸酶活性研究 100 F. columnare G4R3 内源性质粒的研究 102 F. columnare G4R3 衍生菌株 F. columnare G4R3M 的筛选 107 2 实验结果109 F. columnare G4R3 基因组 DNA 的提取 109 F. columnare G4R3 的 DNA 核酸酶活性 109 F. columnare G4R3 内源性质粒 FcG4P 111 iii F. columnare G4R3 质粒 FcG4P 的去除 121 F. columnare G4R3 衍生菌株 F. colu