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1.1 DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） 基因转移工具（“分子运输车”） 　　基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具： 识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。 约4000种。 1、来源： 2、种类： 3、作用： 4、结果： 形成两种末端 一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶 黏性末端 平末端 限制酶切割DNA后形成的末端——黏性末端、平末端是如何形成的？ 重播 什么叫黏性末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。 SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端 。 2、“分子缝合针”──DNA连接酶 切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？ E.coliDNA连接酶：连接黏性末端 T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端 （1）种类： （2）作用： 形成磷酸二酯键 （3）结果： 形成DNA双链 DNA连接酶 DNA聚合酶 连接DNA链 双链 单链 连接部位 在两DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键 DNA聚合酶和DNA连接酶有何区别？ 3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 　　 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！如何送入呢？ 具备什么条件才能充当“分子运输车”？ （1）作为运载体的必要条件 能自我复制 有一个至多个限制酶切割位点 有遗传标记基因 对受体细胞无害 能与目的基因结合 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 比较容易得到 （2）运载体的种类 质粒 λ噬菌体的衍生物 动植物病毒 （3）作用： 将外源DNA送入受体细胞 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。 练习 在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶 不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D 练习 3) 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C 练习 T 磷酸二酯键 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A 磷酸二酯键 基因进入受体细胞的载体 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？ E.coliDNA连接酶：连接黏性末端 T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端 思考 在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？ 现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？ 怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？