实验五宫颈癌hela细胞培养2.pptVIP

实验五 宫颈癌HeLa细胞株培养 三、培养基的配制、细胞传代培养 一、实验目的 熟练掌握DMEM（高糖型）培养基的配置方法 熟练掌握细胞传代培养的操作。 观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 二、实验原理 组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。 贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培养，对细胞进行传代扩增。 对于贴壁不太紧的细胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如HeLa、colo205贴壁细胞，则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。 常用的消化液为胰蛋白酶。 胰酶消化的原理： 胰酶是一种蛋白酶，通过特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解，致使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。 细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为0.25%，PH为7.2-7.4之间。 胰酶消化的程度是一个关键：消化过度会对细胞活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，甚至造成细胞破碎；消化不足则细胞难于从瓶壁吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 一般消化时间为1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。 三、仪器、材料和试剂 超净工作台 微孔过滤器 倒置显微镜 高压灭菌锅 电子称 磁力搅拌器 超低温冰箱 二氧化碳培养箱 （二）材料 细胞培养瓶 微量加样器（移液枪） PH试纸 培养细胞 （三）试剂 HCL DMEM干粉 小牛血清、双抗、L-谷氨酰胺 碳酸氢钠溶液 胰酶 三蒸水 四、实验步骤（一）DMEM合成培养基的配置 配置100ml DMEM母液： 1、每2两小组合称DMEM干粉1.35g，溶于100ml的三蒸水。 2、置于磁力搅拌器上搅拌直到液体变为澄清为止。约30分钟。 3、溶好后于超净工作台中进行0.22um过滤器滤过除菌，分装至试剂瓶中。 瓶口封好，-20℃或4℃贮存。 （二）双抗的配置 双抗：（100000u/ml） 160万单位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20万单位/ml 1g链霉素+5ml 3DW = 200000ug/ml 各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22um过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。 （三）谷氨酰胺储备液（200mM）配置 1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（30mg/ml=200mM),0.22um过滤至1.5ml离心管中。 -20℃贮存。 注：200mM=200mmol/L（毫摩尔每升) （四）饱和NaHCO3的配制 每组称取10g的NaHCO3溶于200ml 3DW 中，过滤除菌后分装于1.5ml离心管。 4℃保存 （五）小牛血清的处理 新买的新生小牛血清一定要灭活； 将新生小牛血清不开封置于56℃水浴锅中30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 已灭活的血清贮存于4℃。 （六） DMEM生长培养基的配制 传代培养步骤（以下均为无菌操作） 从培养箱中取出原代培养细胞并置于超净工作台，弃去培养液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使细胞贴壁面充分浸润，当见到细胞贴壁面的瓶壁出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量培养液终止消化，吹打分散。 具体操作： 每两个小组共用一个培养瓶配制100ml的生长培养基 每人取8ml培养基到自己的细胞培养瓶内 向细胞培养瓶内接种300ul的HeLa细胞株原液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖、平放 观察 倒置显微镜的使用方法 利用课余时间和下次实验课时间用倒置显微镜进行观察。 五、实验报告 描绘在倒置显微镜下观察到的现象。 六、思考题 如何防止传代过程的可能污染？血清在细胞培养中有何作用？为什么配置培养基之前要反复处理配置用水并事先高压处理？配置培养基时调节PH值的目的是什么？ * * （一）仪器 10% — 5 小牛血清 100u/ml 100000u/ml 50ul 双抗 0.3mg/ml 30mg/ml 500ul 谷氨酰胺 — — 44ml DMEM母液 终浓度 储备液浓度 50ml培养液 NaHCO3调pH至7.0