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枣果病原真菌的分离鉴定及特性分析 　　摘要：对云南省蒙自市6个主要枣树栽培品种储藏期的腐烂果实表面的病原真菌进行分离和鉴定，得到25株优势病原真菌，分别扩增得到核糖体DNA转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列，通过对ITS的生物信息学和系统发育分析，并结合菌落形态特征，鉴定病原真菌分别为链格孢属（Alternaria sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、葡萄座腔菌属（Neofusicoccum sp.）和脉纹孢菌属（Neurospora sp.）。 　　关键词： 枣果； 采后病害； 病原真菌； rDNA-ITS； 生物信息学； 序列分析 　　中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0070-07 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.020 　　鼠李科（Rhamnaceae）植物枣（Zizyphus jujube Mill）是中国的原产果树之一，已有数千年的栽培历史[1]。枣树在中国分布面广、适应性强、品种多、风味好，深受广大群众的喜爱，已成为中国果树发展的新热点[2]。蒙自小枣是云南蒙自较为古老的地方品种，早在明末清初已有栽培记载[3]。蒙自小枣果实近圆形，平均单果重7 g。近年来，蒙自小枣以其外观亮、皮薄、肉厚且细腻、味特甜、口感好、品质佳、早熟（较国内其他枣种早熟半个月以上）等优势热销省内外[4]，是蒙自三大果林经济作物（小枣、大枇杷、甜石榴）中单位面积产值最高者。 　　枣果的自然保鲜能力较差，在贮藏中果实极易感染微生物而引起腐烂变质失去商品价值，严重制约了中国红枣产业的健康发展。枣果采后病害可分为2种类型，一类是由于生理活动受到不适宜的外界条件干扰而造成的生理病害；另一类是由病原微生物引起的病理病害（侵染性病害）。据国内外文献报道，病原微生物可侵染枣叶片和枣果，枣叶片上的主要病害有枣疯病[5，6]、枣锈病[7]和枣叶斑病[8]等；枣果实主要病害有枣轮纹病[9]、枣缩果病[10]、枣黑腐病[11]、枣炭疽病[12]等。其中枣疯病、枣锈病和枣缩果病被称为枣树的三大病害。在果实储藏期，链格孢霉（Alternaria tenuis）、茎点霉（Phomaglomerata）等可引起枣果斑点性病害；镰刀菌（Fusarium oxysporum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）可引起枣果实腐烂。因此对采摘后的枣果致病真菌进行分离和鉴定可以为科学用药提供有效的指导。 　　传统致病菌的鉴定主要通过形态学特征进行，受很多因素的限制。随着分子生物学技术的发展，18S rDNA基因序列在真菌的分类和鉴定系统中的应用越来越广泛[13，14]。保守的18S和28S序列有利于属的鉴定，核糖体DNA转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）则多运用于种的鉴定。对ITS序列进行生物信息学和系统发育分析，可以快速阐明菌株之间的进化关系和种群间的亲缘关系[15]。以上方法可以为快速和准确的鉴定植物真菌病害提供一定基础。 　　本研究以云南蒙自地区的冰糖枣、蒙自小枣、特早金脆蜜枣、胎里红枣、中华梨枣和早甜蜜甲枣等6个品种为主要研究对象，分离和纯化引起贮藏期的主要致病真菌，在传统形态鉴定的基础上，对贮藏期腐烂枣中分离到的菌株进行rDNA-ITS序列分析和分子鉴定，为不同品种枣贮藏期真菌病害防治提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　从云南省蒙自市文澜镇白路脚村蒙鑫大棚枣园基地采得冰糖枣、特早金脆蜜枣、胎里红枣、中华梨枣和早甜蜜甲枣5个品种的枣果，从云南省蒙自市红寨乡高家寨小枣种植园采得蒙自小枣。共采集枣果样品64份，其中高家寨枣园12份，蒙鑫大棚枣园52份，放入果品专用保鲜袋，4 ℃保存。 　　1.2 生化试剂 　　离心柱型基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；1×TAE Buffer（0.04 mol/L Tris-Cl，0.001 mol/L EDTA，pH8.0），琼脂糖（AR），0.5 mg/mL EB，DL5 000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲdigest DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京东盛创新生物科技有限公司）。 　　1.3 培养基 　　PDA培养基：取马铃薯200 g去皮切碎，加入800 mL去离子水，煮沸30 min，冷却后双层纱布过滤，取滤液，加葡萄糖20 g，定容至1 L，高压蒸汽115 ℃灭菌20 min，备用。 　　PDA固体培养基：在PDA培养基的基础上，加入1.5%～2%的琼脂粉