实验 胡萝卜素的柱层析分离1.docVIP

胡萝卜素的柱层析分离法 一、实验目的 1.了解吸附层析法的基本原理及应用。 2.掌握吸附层析的基本操作技术。 二、实验原理 ????胡萝卜素存在于辣椒和胡萝卜等黄绿色植物中，因其在动物体内可转变成维生素 A ，故称为维生素 A 原。胡萝卜素可用酒精、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，且能被氧化铝（ Al 2 O 3 ）所吸附。由于胡萝卜素与其它植物色素的化学结构不同，它们被氧化铝吸附的强度以及在有机溶剂中的溶解度都不相同，故将提取液利用氧化铝层析，再用石油醚等冲洗层析柱，即可分离成不同的色带。同植物其它色素比较，胡萝卜素吸附最差，跑在最前面，故最先被洗脱下来. 三、实验材料 1. 材料： 新鲜红辣椒（或干红辣椒） 2. 试剂 （1）95％乙醇 （2）石油醚及1％丙酮石油醚（1：100，体积比） （3）Al2O3(固体) （4）无水硫酸钠NaSO4 （5）三氯化锑氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100 mL氯仿溶解后，贮于棕色瓶中） 3. 器具 剪刀，研钵，试管，量筒 100mL ，吸管 5mL ，分液漏斗100 mL，小烧杯100mL，玻璃层析住（1cm×16cm），滴管，铁架台，蒸发皿、恒温水浴锅，天平，玻璃棒，棉花，滤纸。 四．实验操作 1 ．提取 方案一：称取新鲜红辣椒 12g 左右（或干红辣椒 2 ～ 3g ），去籽剪碎后置研钵中研磨。加入95％乙醇 4 mL ，研磨至提取液呈深红色，加入丙酮 4 mL 继续研磨至成匀浆，加入蒸馏水 20mL 。混匀后，以四层纱布（或棉花）过滤，收集全部滤液至分液漏斗中，加入石油醚 6mL ，振荡数次后静置片刻。弃去下面的水层，再以蒸馏水 20 mL 洗涤数次，直至水层透明为止，借以除去提取液中的乙醇。将桔黄色的石油醚层倒入干糙试管中，加少量 NaSO4 除去水分，用软木塞塞紧以免石油醚挥发。 方案二：取干红辣椒皮2g,剪后放入研钵中，加95％乙醇4mL，研磨至提取液呈深红色，再加石油醚6mL研磨3～5min，此时，若石油醚挥发过多，可再加4mL左右，提取液颜色愈深则表示提取的胡萝卜素愈多。将提取液先用纱布过滤，再置分液漏斗中，用20mL的蒸馏水洗涤数次，直至水层透明为止，借以除去提取液中的乙醇。然后将红色石油醚层倒入干燥试管中，加少量无水硫酸钠除去水分，用软木塞塞紧试管口，以防石油醚挥发。 2 ．层析柱的制备 ?取直径为1cm×16cm的玻璃层析柱并垂直安装在铁架台上，在其底部放少量棉花，然后自柱的顶端沿管内壁缓缓加入石油醚－氧化铝悬浮液至柱顶部，待氧化铝在柱中沉积约10cm时，于其柱床上铺一张略小于层析柱内径的圆形的小滤纸（或棉花）。（装柱要均匀，无断层，柱床表面要水平）。 3.层析 ????用细吸管取样品-石油醚提取液1ml，沿柱内壁缓缓加入(注意切勿破坏柱床面)，待样品-石油醚提取液全部进入层析柱时立即加入含1％丙酮石油醚冲洗，使吸附在柱上端的物质逐渐展开成为不同的色带。仔细观察色带的位置、宽度与颜色，并绘图记录。跑在最前方的桔黄色带即为胡萝卜素，待该色素接近层析柱下端时，用一试管接收此桔黄色液体，然后倒入蒸发皿内，于 80 ℃ 五．注意事项 1 ．对新鲜红辣椒等实验材料的研磨一定要仔细，以彻底破坏植物细胞以释放胡萝卜素，实验中加入 4mL 丙酮有利于对胡萝卜素的提取，此法可分离得到 5 ～ 6 条色带，最前面的色素为胡萝卜素（若分离条件控制得好，该色带又可分离成三条较小的色带，分别为 a ， b 和 g 胡萝卜素），紧随其后者分别为蕃茄红素和叶黄素等。 2 ．附剂的活性和吸附剂的含水量有关，若先用高温处理（ 350 ℃～ 400 3 ．装柱时，不能使氧化铝有裂缝和气泡，否则影响分离效果。氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的 3/4 ，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整若顶部不平，将产生不规则的色带。 溶媒中丙酮可增强洗脱效果，但含量不宜过多，以免洗脱过快使色带分离不清晰。 4 ．分离过程中，要连续不断地加入洗脱剂，并保持一定高度的液面，在整个操作过程中应注意不使氧化铝表面地溶液流干。 5 ． SbCl3 腐蚀性较强，使用过程中勿接触皮肤。 SbCl3 遇水生成碱式盐 [Sb(OH)2Cl]] 再变成氯氧化锑 (SbOCl) ，此化合物与胡萝卜素不发生作用，可出现混浊。 六、思考题 1 ．吸附层析法的基本原理是什么？ 2 ．为使胡萝卜素的分离效果更佳，操作中应注意什么？