活性检测20日.pptxVIP

基因的克隆与表达专题之八 表达产物AKP蛋白的检测关于AKP (E.coli alkaline phosphatase）AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下:水解多种磷酸单酯化合物需要镁和锰离子为激活剂沉降系数(单体)6.0 at pH8.0沉降系数(二聚体)6.2S沉降系数(四聚体)9.6S固有粘度3.4cm3/g电泳迁移率3.3×10-5cm2/V sec at pH7.6等电点pH 4.5等离子点pH 6.3摩擦比率1.05MWw(67-98)×103 at pH8.0MWz(88-99)×103 at pH8.0MWZ+1(86-110)×103 at pH8.0吸光率(278nm for 1mg/ml)0.72激活剂Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+抑制剂氰化物, 焦磷酸盐热稳定性85℃加热30分钟仍保留活性，Mg2+存在时可增加酶的热稳定性AKP的理化性质蛋白检测指标根据蛋白的特性活 性纯 度电泳，沉降、晶体衍射等分子量1、质电泳，分子筛，沉降系数等定 性Western，测序等结 构光/色谱，晶体衍射等分光， 凯氏定氮等蛋白浓度获得产量2、量表达产率1、酶活测定：底物显色法AKP＋PipNP （对硝基酚）pNPP（对硝基酚磷酸）黄色无色Na3PO4405nm有特征吸收本实验410nm测定OD值比尔-朗伯定律：ODλ = ?LC εpNP=17500L ·mol-1 · cm-1 C:光吸收物质的浓度（mol·L-1） L:光路长度（cm）1、酶活测定：底物显色法+40μL酶液360μL测活液30℃反应10min加入3.6ml终止液终止反应于410nm处测定吸光值注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.1～0.8之间酶活力单位数＝（其中n为稀释倍数） 实验操作1. 菌体加入15mL匀浆液2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 取1ml粗匀浆置于冰上，准备测活4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4℃, 12000rpm×10min离心，留上清液5. 上清液制样：匀浆上清 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 余下的上清置于冰上，准备测活一、细胞破碎与制样组别空白零对照空载体表达阴性对照(蓝斑)pETBlue-AKP阳性对照AKP表达粗匀浆上清粗匀浆上清匀浆液（uL）4000000粗匀浆（uL）040400400离心上清（uL活液（uL）360360360360360360室温反应10min终止液（mL）3.63.63.63.63.63.6OD410酶的活力二、AKP酶活性分析谢谢！　2、分子量测定：SDS-PAG电泳a：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺m：溶液的总体积一般按a:b = 29:1 或a:b = 29.2 ：0.8配制储液a+b bT= * 100% C= * 100% m a+bTEMED (加速剂)聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺APS (过硫酸铵,催化剂)　C：表示交联剂所占百分比T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 改变T值改变胶孔径T分离范围（KD)１５１２－４３１０１６－６８７.５３６－９４５.０ ５７－２１２－Tris-Gly pH 8.3样品浓缩胶 pH 6.8浓缩后的样品Gly－ 、 Pr－ 、Cl－分离胶 pH 8.8Tris-Gly pH 8.3＋SDS的 浓 缩 效 应电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成Cl－的快速泳动在其后面形成低电导，高电压梯度区带动Pr－和Gly－快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr浓缩成狭小薄层电荷效应、凝胶的分子筛效应SDS的变性作用SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开∴ 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质－SDS复合物由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比∴ SDS中，SDS－蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关空载体离心后离心前MKd 9766453614实验操作三、 AKP的SDS－PAGE电泳1. 洗净胶板，架好和固定好胶板2. 配置12%分离胶（20mL）3. 分离胶