环境因素对亚油异构酶的影响.ppt

5、测定粗酶液中的亚油酸异构酶酶活力 1）取2ml粗酶溶液试管解冻后，加入2ml 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.4)溶解，再加5mL的亚油酸及1mL的吐温80，加塞，混匀10min，置于44℃摇床（200r/min）保温酶转化10 h。 2）将酶转化液移入60mL梨形分液漏斗中，并用5mL正己烷洗涤试管后一并倒入分液漏斗中。然后加入25mL正己烷振荡萃取10分钟。静置分层后放弃下层水相液体，加入10mL蒸馏水振荡水洗，静置后弃去下层水相液体，水洗三遍后，萃取液移至干净试管中。 3）取垫有滤纸的直径为50mm的小漏斗盛装少量无水硫酸钠，将萃取液通过无水硫酸钠以吸去萃取液中的水分和水溶性物质，直至无乳化层止。将吸去水分和水溶性物质的正己烷萃取液移入25mL容量瓶中，加入正己烷定容，摇匀，在234 nm处测定其吸光值，对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量。 此次测得的吸光值均为3.00，其原因是经无水硫酸钠处理后萃取液仍很混浊，有乳化层存在。可能与亚油酸和T-80浓度高、静置分层不充分有关。 4）计算酶活力，一个亚油酸异构酶活力单位U定义为，1 h内生成1μg的共轭亚油酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位。 K×G 酶活力(U/ml)= ———— V×T 式中，K为酶液稀释倍数；G为所生成的共轭亚油酸量(μg)；V为吸取酶液体积 ；T为反应时间(h)。 内容三、不同培养条件下各菌株亚油酸异构酶的 纯化及酶活测定 实验步骤： 配制试剂→饱和（NH4）2SO4分级沉淀→透析袋预处理 →透析除盐→聚乙二醇20000 浓缩处理→测酶活及蛋白质浓度→ Sephadex G-100凝胶过柱层析（Sephadex G-100凝胶处理→装柱、柱平衡、加样 →过柱） → 紫外检测、收集、测酶活→聚乙二醇20000 浓缩处理→测酶活及蛋白质浓度→冻干保存 1、配制试剂 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.0)： 2000 mL /大组 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.4 )： 100 mL /大组 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0 )： 3000 mL/大组 1mol/L BaCl2： 200mL/班 2、饱和（NH4）2SO4分级沉淀 在粗酶液中添加经过研磨的硫酸铵，至饱和度为40%，4℃静置5小时后，离心(8000r/min，30min，4℃)，移出上清液(粗酶液)并计量体积；在冰水浴条件下，再向上清液加入硫酸铵至饱和度为80%的4℃静置过夜，离心(10000r/min，20min，4℃)收集沉淀。 3、透析除盐 1）将经硫酸铵盐析所得的酶沉淀用2～3倍体积的pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后装入经过预处理的透析袋(D16mm，透析分子量8000Da，剪成15～20cm长的片断)，扎紧后浸入装有pH4.0磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液的大烧杯中，4℃下磁力搅拌，透析除盐。 2）开始每隔4h左右更换一次缓冲液，几次后可适当延长换液的间隔时间。用1mol/L BaCl2溶液检查脱盐情况，至无沉淀产生时即认为透析达到平衡。3）将上述装有酶液的透析袋直接填埋于装有聚乙二醇20000的烧杯中，放入冰箱内观察脱水情况，直至酶液样品浓缩到需要的体积。 4、测定粗酶液中的亚油酸异构酶酶活力 1）配制亚油酸乳浊液 称取50mg的亚油酸加入10mg的T-80，振荡混匀10min，移入50mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度，得到含亚油酸、T-80 为1mg/mL和0.2mg/mL 的乳浊液，置冰箱保存。 2）取1ml已透析除盐的粗酶溶液，1mL亚油酸乳浊液，18mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.4)于100mL三角瓶中（0.05mg/mL亚油酸），振荡混匀10min，置于38℃摇床（200r/min）酶转化20h。 3）取酶转化液5mL移入60mL梨形分液漏斗中，加入20mL正己烷振荡萃取10分钟。静置分层后放弃下层水相液体，加入5mL蒸馏水振荡水洗，静置后弃去下层水相液体，水洗一遍。 3）取垫有滤纸的直径为50mm的小漏斗盛装少量无水硫酸钠，从分液漏斗瓶口将萃取液倾出，使之通过无水硫酸钠以吸去萃取液中的水分和水溶性物质，直