毕赤酵母电转方法及转化子的筛选.docxVIP

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜； 2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜 (约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 对于LOX