鼻气管鸟杆菌的分离鉴定及致病性研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 鼻气管鸟杆菌的分离鉴定及致病性研究 鼻气管鸟杆菌的分离鉴定及致病性研究 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 中 文 摘 要 鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale, ORT）是一种不运动、高度多形性、 无芽孢的革兰氏阴性(G-)小杆菌。在血液琼脂上生长缓慢，5%-10%CO2 条件下，于 5% 绵羊血液琼脂 37℃恒温培养 24h 后可形成针尖大小、不溶血的灰白色圆形菌落。培养 48h 后可形成圆形、灰色到灰白色奶酪状的直径为 1-3mm 的小菌落，有时颜色稍变浅红 并发出类似酪酸的气味。临床上以呼吸道症状、生长障碍、死亡率增加为特征，病理上 以严重的单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、气囊炎为特征。目前，该病在欧洲、美洲、 南非的许多发达国家流行，并呈上升的趋势，严重危害养禽业的发展，因此，应引起人 们的广泛注意。我国陈小玲等首次在国内分离到 2 株 ORT，但是还未见从山东省分离到 该菌的报道，本课题应用生化试验和 PCR 方法首次从山东省的商品肉鸡中分离到 5 株 ORT，并通过不同途径感染雏鸡，探讨 ORT 对雏鸡的致病性和体内抗原的分布，为更 好的控制本病提供理论依据。 本试验采集山东省不同地区有呼吸道症状的病死鸡进行鼻气管鸟杆菌 （Ornithobacterium rhinotracheale ,ORT）的分离，根据培养特性、生化试验和玻片凝集 试验对分离的菌株进行鉴定。应用 PCR 方法对分离菌株 16S rRNA 基因的一段保守序列 进行扩增，应用琼脂扩散沉淀试验（AGP）对分离菌株的血清型进行鉴定，并对分离株 进行药敏试验。试验共分离到 5 株 ORT，所有分离菌株均能扩增到一段 671bp 的特异性 片段，而阴性对照菌株的扩增结果为阴性；5 株 ORT 分离菌株可分为 3 个血清型，其中 血清 A 型 3 株，血清 B 型 1 株，血清 D 型 1 株；分离 ORT 菌株对羟氨苄青霉素、头孢 曲松、丁胺卡那、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。 选择 1 株血清 A 型 ORT 分离菌株分别通过气管、消化道和肌肉注射接种途径人工 感染肉雏鸡和 SPF 雏鸡，观察试验鸡的发病情况及症状，称量各试验组和对照组的增重； 利用建立的 PCR 检测方法对试验组和对照组排菌情况进行动态观察；于感染后不同时 间随机剖杀试验组和对照组鸡只，采集心脏、肝脏、肺脏和气管等组织固定、切片、H.E. 染色，观察各器官病理组织学变化，利用建立的 IFA 方法对 ORT 在雏鸡体内的分布进 行研究，并进行血常规和血液生化指标检测。ORT 接种后，引起雏鸡的呼吸困难、咳嗽 等症状，增重明显降低；病理组织学变化以肝脏、心脏组织细胞变性、坏死，气管和肺 脏广泛性出血和炎性细胞浸润为特征；IFA 阳性信号主要分布于肺脏和气管；从感染后 的第 2d 到第 8d 一直可持续排菌；HGB、WBC、RBC、BUN 和 AST 发生显著变化。 以 1 株 ORT 分离株免疫清洁级新西兰白兔，高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖 G200 柱纯化，制得第一抗体。以 FITC 标记的山羊抗兔 IgG 为第二抗体，通过反应条件 的优化，建立了 ORT 间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。试验结果表明：一抗的最佳 稀释度为 1:25，感作时间为 4℃过夜，二抗的最佳工作浓度为 1:200，感作时间为 37℃1h， ORT 特异性黄绿色荧光最清晰。应用建立的 IFA 对 ORT 人工感染雏鸡的各组织器官进 行检测，气管、肺脏、肝脏、心脏均可检测到 ORT，其中气管和肺脏检出率最高，表明 这两个器官是 ORT 的主要靶器官。研究表明本法用于 ORT 的诊断具有简单、快速、特 异性强等特点，是对 ORT 进行检测和抗原定位的良好方法。 关键词：鼻气管鸟杆菌；分离鉴定；致病性；间接免疫荧光；抗原定位 Abstract Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) is a Gram-negative pleomorphic, rod-shaped bacterium. It grows slowly, producing only pinpoint colonies on blood agar at 37℃ in the presence of 5% CO2 at 24h. Optimal growth occurs when plates have been incubated for 48h .Colonies then appear gray to grayish white, opaque, convex and c