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带叶兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术的研究 　　摘要：为初步建立带叶兜兰组织培养快速繁殖体系，对带叶兜兰（Paphiopedilum hirsutissimum）成熟种子进行无菌萌发、原球茎分化及根诱导研究。结果表明：有机添加物香蕉对原球茎的诱导与分化有较好的促进作用；培养基配比为：1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭，对原球茎的诱导和增殖有明显的促进作用；不同浓度配比的6-BA和NAA对芽增殖影响不明显，但低浓度的NAA对芽的分化影响显著；1/2 MS+IBA 0.2 mg/L对带叶兜兰的根诱导效果最为理想；碎树皮为栽培基质的移栽成活率达96%。 　　关键词：带叶兜兰；无菌萌发；快繁；试管成苗；培养基 　　中图分类号： S682.310.4+3文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）09-0030-04 　　兜兰属（Paphiopedilum）隶属于兰科（Orchidaceae）植物，主要分布于我国贵州、广西和云南[1]。兜兰具有很高的观赏价值，十分珍贵，野生资源遭到过度采掘，已经到了濒临灭绝的边缘，被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》的保护对象[2]。兜兰种子没有胚乳，在自然环境中须与真菌共生才能萌发，且萌发率极低[3]。而兜兰的克隆增殖是世界性难题，即使能诱导出愈伤组织或幼芽，增殖率仍很低[4]。目前，利用种子非共生无菌萌发成苗是兜兰植物规模化快繁的唯一途径，是解决其保育问题的重要手段。 　　带叶兜兰（Paphiopedilum hirsutissimum）是兜兰属地生或半附生草本植物，是兰科中最原始的类群之一，株形娟秀，花朵造型独特，花期持久，被誉为兜兰中的“美娇娘”[5]。目前，关于兜兰属其他植物的种质保护与无菌苗快繁技术已有很多报道[6-10]，但与带叶兜兰相关的研究鲜有报道[11-12]。研究了带叶兜兰种子无菌播种与试管快速成苗体系，探讨带叶兜兰组培快繁技术，以期为带叶兜兰人工快繁的规模化和产业化提供科学依据和技术支持，为最终实现带叶兜兰种质资源的保育及可持续开发利用奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　带叶兜兰（Paphiopedilum hirsutissimum）植株为贵州省林业科学研究院种质资源。5月盛花期进行人工同种异株授粉（图1）；当年9月左右，种子干燥接近成熟，从授粉到蒴果成熟开裂需要120 d左右（图2）。 　　1.2试验方法 　　1.2.1种子预处理先将带叶兜兰种子荚流水冲洗5 h后移入超净工作台，用75%乙醇浸泡10 min，0.1%次氯酸钠浸泡15 min，后用无菌水冲洗3～5次。用无菌滤纸吸干多余水分，切开种皮，将种子撒落在所配制的各种固体琼脂培养基上。 　　1.2.2培养基 　　以1/2 MS为基本培养基。培养基中加葡萄糖30 g/L（生根为20 g/L）和琼脂6 g/L作为固定剂，加热完全融化后调至pH值5.2～5.4，分别装40 mL到培养瓶中，用瓶盖封口，每一个处理接种15～20瓶，放在蒸汽高压锅（120 ℃，20 min）内灭菌，室温冷却后待用。 　　1.2.2.1不同有机添加物对原球茎诱导与分化的影响 　　将种子分别接种到5种培养基：（M1）1/2MS+10%马铃薯+20%葡萄糖+0.4%琼脂+0.1%活性炭；（M2）1/2MS+10%椰乳+2.0%葡萄糖+0.4%琼脂+0.05%活性炭；（M3）1/2MS+10%香蕉+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭；（M4）1/2MS+10%苹果汁+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭；（M5） 1/2MS+15%椰乳+2.0%葡萄糖+04%琼脂。 　　1.2.2.2不同浓度6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，简称6-BA）和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，简称NAA）对芽增殖分化的影响 　　前期试验分别对6-BA、NAA进行激素组合及配比试验，筛选增殖分化有效培养基配方：（N1） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭；（N2） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+005%活性炭；（N3） 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭；（N4） 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+0.1 mg/L NAA+2.0%葡萄糖+0.5%琼脂+[JP3]0.05%活性炭；（N5） 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NA