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微生物天然产物早期鉴别及去重复的方法的研究进展 　　摘要：微生物天然产物具有独特的结构多样性。随着研究的深入，研究者在进行天然产物筛选时遇到已知化合物的机会加大，有必要在研究的早期对粗提物中的化合物进行早期鉴别及去重复，以减少不必要的人力、物力及财力的浪费。文章对涉及天然产物早期鉴别及去重复的方法——薄层层析技术（TLC）、高效液相色谱（HPLC）-光谱联用技术及天然产物数据库在天然产物早期鉴别及去重复中的应用进行综述，以期为新药的研究与开发提供一些借鉴。 　　关键词：微生物天然产物；早期鉴别；去重复；薄层层析；液相色谱-光谱联用技术；数据库 　　中图分类号：TQ028.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5409-06 　　20世纪20年代弗莱明博士从青霉菌中发现青霉素揭开了有目的地利用微生物次生代谢产物的序幕。经过80多年的研究，目前已经报道的具有生物活性的微生物次生代谢产物达到了20 000个以上[1]。其中，一些具有重要的生物活性的微生物天然产物已被开发成为医药、农药[2-4]，如青霉素、头孢菌素、他汀类药物、环孢菌素A、阿维菌素、Strobilurin类杀菌剂等，在农药及医药中占据了相当大的比重。微生物天然产物成为新药开发的重要源泉。尽管跨国医药企业在20世纪90年代对天然产物研究与开发的兴趣曾经一度下降，但由于组合化学及高通量筛选并未为其带来预期的结果，这些企业对天然产物的研究已经在复苏，天然产物在新药的研究与开发中发挥着重要的作用[5-10]。 　　据估计，开发一种新药平均要花10～15年的时间，总费用已超过10亿美元[11]。在从微生物天然产物中进行药物筛选研究时，研究者经常会碰到已知的化合物或不感兴趣的化合物。为了避免不必要的人力、物力及财力的浪费，研究者应尽可能在研究的早期对微生物粗提物中的化合物进行初步鉴别，排除其中的已知化合物或重复的化合物。微生物天然产物早期鉴别及去重复的一般流程见图1。以往人们利用纸层析、薄层层析进行微生物天然产物的早期鉴别及去重复。目前，高效液相色谱（HPLC）已广泛应用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复，与高效液相色谱技术联合使用的现代分析技术的发展，使微生物天然产物的早期鉴别及去重复更为方便。而天然产物数据库的建立，则大大简化了微生物天然产物的早期鉴别与去重复的过程。本研究对用于微生物天然产物的早期鉴别及去重复的方法进行总结，以期对微生物天然药物的研究与开发提供一点借鉴。 　　1 薄层层析 　　微生物在次生代谢过程中产生复杂的次生代谢产物。这些复杂组分的物理化学性质不同，其在不同的溶剂系统中扩散的速度不同。用于微生物次生代谢产物分离的材料包括纸、硅胶、氧化铝等。事实上，从20世纪40年代开始纸层析技术就被用于微生物产生的化合物的早期鉴别与去重复。在20世纪80年代，Zahner等[12]根据不断增加的薄层层析（TLC）色谱及显色剂知识，提出了一个基于薄层层析的微生物天然产物的筛选策略——化学筛选。微生物提取物经薄层硅胶层析展开后，可在紫外及可见光下记录层析样品的层析情况；另外，利用多个显色剂对层析后的样品进行显色。通过与数据库中已知化合物进行对比，可初步确定样品中的化合物是否为数据库中的化合物。该方法在德国汉高研究所（HKI）和HOECHST制药公司得到运用，利用该方法对8 000株微生物进行了筛选，分离到259个化合物，其中129个化合物是新结构化合物。新化合物分离的比率达到50%[13]。云南大学微生物研究所李铭刚等[14，15]通过与HKI合作，利用其TLC数据库对一株嗜碱放线菌的次生代谢产物进行了早期鉴别，从中分离到了两个活性化合物。Filtenborg等[16，17]也采用TLC方法，结合可见光、紫外线及显色剂，对真菌产生的毒素进行了筛选。但是该方法的最大缺陷是分辨率不高、自动化水平不高，特别是对一些未知化合物缺乏有效的鉴别手段，对化合物的快速鉴别依赖于数据库中化合物的数量。 　　2 液相色谱（LC）技术与光谱技术联用 　　20世纪60年代末至70年代初，科克兰（Kirkland）等人开发了世界上第一台商业高效液相色谱仪，开启了HPLC时代[18]。随着技术的发展，如柱料的改进、高压泵的应用，HPLC技术的分离效果提高迅速，而与计算机联用则大大提升了高效液相色谱的自动化程度。LC技术已广泛应用于生物活性物质的分离、纯化。将具高分离性能的LC技术与能够获取丰富化学结构信息的光谱技术相结合，通过一次或少数几次分析即可全面地获得整个微生物粗提物的化学组成、含量及结构等信息，在研究的早期即鉴别或鉴定出化合物的结构及预测出新化合物的存在，达到对生物活性物质进行快速筛选的目的，大大促进了微生物来源的有生物活性的新化合物的发现。