产微囊藻毒素藻株的PCR检测方法的研究-遗传学专业论文.docxVIP

Classified Index: X172 U.D.C: 579 Dissertation for the Master Degree in Science STUDY ON PCR METHOD FOR DETERMINING MICROCYSTIN PRODUCING ALGAE STRAINS Candidate： Sun Shuwen Supervisor： Associate Prof. Ma Meirong Vice Supervisor： Associate Prof. Xu Zhong Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Genetics Affiliation： School of the Ocean Date of Defence： June, 2010 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士论文 哈尔滨工业大学理学硕士论文 - - I - 摘 要 水华蓝藻可以产生许多各种不同的毒素（蓝藻毒素），其中发生最频繁、危 害最大的是一种肝毒素：微囊藻毒素（MC）。淡水中，微囊藻毒素（MC）主要 是由微囊藻、鱼腥藻和浮丝藻产生的。蓝藻毒素的检测是研究蓝藻水华的重要方 面，快速有效的检测方法对于判断湖泊水质好坏、建立水华预警系统、提出合理 的治理方法均有重大意义。 蓝藻水华发生时，有毒蓝藻和无毒蓝藻同时发生，不能在常规的显微镜下进 行区分。基于微囊藻毒素合成酶基因（mcy）的分子生物学方法能够对潜在的产 毒蓝藻进行检测。MCs 是由微囊藻毒素合成酶基因（mcy）编码的非核糖体酶复 合物产生的，mcy 已经在产 MC 的种类中被标记。生物合成基因的存在已经被证 明是 MC 产生的先决条件。铜绿微囊藻的 mcy 基因簇包括嵌入在两个双向转录操 纵子中的 10 个基因：mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、 mcyI 和 mcyJ。 本文针对微囊藻毒素主要合成酶基因 mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE 和 mcyG 基因设计了 7 对检测引物，其中，针对 mcyG 基因设计了 2 对引物。同时针 对蓝藻藻蓝蛋白保守基因序列和微囊藻 16srRNA 保守基因序列设计了两对对照 引物，来对照蓝藻和微囊藻的存在。通过对 16 种蓝藻的 PCR 检测，结果显示 6 种蓝藻基因组对 6 对检测引物的 PCR 反应均显示阳性。通过高效液相色谱（HPLC） 检测相对比，其结果基本一致。 通过优化 PCR 扩增条件，成功对 mcyA 保守基因序列引物和藻蓝蛋白保守基 因序列引物两对引物进行双重 PCR，可以在同一组 PCR 反应数据中看到藻蓝蛋 白基因和 mcyA 保守基因序列的存在。这为以后同时检测野外水样中蓝藻细胞总 量和产微囊藻毒素蓝藻细胞的总量的定性和定量检测打下基础。鉴于产微囊藻毒 素微囊藻种类偏多的道理，在双重 PCR 的基础上，加入微囊藻 16srRNA 保守基 因序列引物，对应条带用来指示微囊藻细胞的含量，成功设计三重 PCR。 为了更简便的检测水中微囊藻毒素的存在，采取超声波破碎的方法对藻液进 行简单前处理，进行全细胞 PCR，得到了与使用基因组 PCR 检测一致的结果。 试验中，在 PCR 反应体系中加入 B11 和 B12 碳管纳米材料，结果初步验证 B11 纳米材料对 PCR 扩增具有增效作用。 以上研究结果为野外水华水样的检测奠定了基础。 - - II - 关键词：微囊藻毒素（MCs）；微囊藻毒素合成酶基因（mcy）；多重 PCR；全细 胞 PCR 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 - - PAGE IV - Abstract Cyanobacteria can produce many different kinds of toxins (cyanobacteria toxin), of which the most abundant and the most toxic is a liver toxin: microcystin (MC). In fresh water, microcystin (MC) is mainly produced by Microcystis, Anabaena and Planktothrix. Detection of cyanobacterial toxins is the important aspects for the study of algal blooms. To establish