特殊显微镜工作原理和使用.ppt

第六章 特殊显微镜的工作原理和使用 特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而言，在成像原理、结构和用途上存在差异的显微镜。 这里介绍： 暗视野显微镜、 相差显微镜、 微分干涉显微镜、 荧光显微镜、 偏光显微镜、 倒置显微镜、 实体显微镜、 激光共聚焦显微镜。 一、 暗视野显微镜 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。 (一) 原理和结构特点 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。 暗视野显微镜就是利用此原理设计的。 暗视野显微镜是在普通光学显微镜中去除明视野集光器，换上一个暗视野集光器而成。 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上。 标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。 成像特点及优缺点 在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。 但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。 一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 (二) 制作中央遮光板 普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。 在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。 （三）使用方法 (1)．把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。 (2)．选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。 (3)．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。 (4)．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 (5)．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，找到所需观察的物像。 (6)．观察并记录结果。 要求与注意事项 (1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。 (2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。 (3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。 (4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间不能有气泡存在。 (5)高倍观察：在标本盖玻片上再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。 也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。 （二）相差显微镜 原理和结构特点 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化，于是就能看到物体， 当光波通过透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不同的结构。 用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易分清其内部的细微结构。 但是，光线通过厚度不同的透明物体时，其相位却会发生改变，形成相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。 我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差，这样就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗的不同，能够较清楚地予以区别。 如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱