电泳分离概述幻灯片课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * 4、两性电解质载体(carrier ampholytes) 1)易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保 持稳定的pH梯度。 2)导电性能好——以保持电场强度的均匀性。 3)分子量小——电泳后易分离除去。 4)化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。 5)与样品中各组分不发生化学反应。 * 两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面溶液的pH决定它带电荷的性质。如溶液是pH7，对pI=9的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI=3的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同pI的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷； 另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡，使溶液pH有所改变。当某一两性电解质pI较低，即释放质子(H+)能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性两性电解质。 所以，在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境(水溶液)，使其pH值有所改变。 5、pH梯度的形成 * 等电聚焦电泳的应用 * 等电聚焦电泳的应用 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2、分离效应 PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳（continuous electrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统； 不连续电泳（discontinuous electrophoresis）： 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系； 电荷效应 不连续PAGE 分子筛效应 浓缩效应 连续PAGE * 1）电荷效应: 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。 在直流电场作用下电泳情况示意图 图中A，B，C均为阴离子 分子量大小依次为MA=MBMC， 所带电荷量相同QA=QB=QC。 * 3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。 * 8.3 8.3 8.9 6.7 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。 3、系统的不连续性表现在以下几个方面 * 4、聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1）化学催化系统：AP-TEMED 催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfate，AP） 加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 2）光催化系统：核黄素－光 催化剂: 核黄素（维生素B2） 引发剂: 光 TEMED的存在，可加速聚合。 . CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH- C=O C=O C=O NH2 NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH- C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 * * （1）催化剂和加速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40－60分钟内完成。 （2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。 （3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。 （4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。 （5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合。 5、 影响丙烯酰胺聚合的主要因素 * 聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－亚甲基双丙烯酰胺聚合而