人类染色体标本备及核型分析.ppt

染色体标本制作技术有下述四大发现： 一、美籍华人徐道觉(1952)从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开； 二、Tjio(1956)发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期； 三、LiJ．G．发现PHA(phytohemagglutin)(植物血球凝集素)可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，呈分裂状态； 四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。 （二）染色体显带 人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。 研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。 关于G显带的机理目前有多种说法，较常见的有 1、Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。 2、有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。 一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。总的来说，G显带的机理还未搞清。 三、内容与操作 一、染色体G显带标本的制备 1. 采血：采血过程中严格执行无菌操作。 2．接种：超净工作台内 0.3～0.5ml 轻轻水平摇动混匀。 ３．培养：5%CO2，37℃±5℃恒温箱培养64-65小时；卡介苗注射器(5号针头)向培养瓶中加入20μg/ml秋水仙素（0.01%）一滴，轻轻摇匀，放回温箱继续培养至68小时。 4、离心：10分钟（1500转／分），弃上清液，留下沉淀物。 5、低渗：6～8m1预温37℃的0.075M KCl溶液，沉淀细胞重重冲散，37℃水浴箱30-35分钟。 6、预固定：1ml新配制的固定剂，轻轻冲打，37℃水浴箱中静置5分钟。 7、离心：1500转／分离心10分钟，弃上清液。 6．第一次固定：固定液6～8m1，沉淀物轻轻冲打均匀，37℃水浴箱中静置固定10分钟。 7、第一次离心10分钟(1500转／分)，弃上清液。 8、 重复第6、7步。 9、 制片：留固定液0.2ml～0.4ml，轻轻冲打制成细胞悬液。冰冻载波片，滴管口距离载玻片10～15cm，每片2～3滴。 10、烤片：75℃烤箱烤3小时。自然冷却。 11、胰酶预温：立式染色缸中磷酸缓冲液100ml（ 1／15M NaH2PO4 80.8 ml ，KH2PO4 19.2ml)，2.5％的胰蛋白酶原液1ml配成0.025％的工作液。37℃的恒温水浴箱内预温。 12、显带：不断轻轻摆动，使胰酶作用均匀，处理时间25～90秒钟左右（较陈旧标本时间适当延长，随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长，精确的时间自行摸索）。 取出标本片，立即用37℃预温的生理盐水轻轻漂洗两次，去除片子上的胰酶溶液。 13、染色：37℃预温的Giemsa工作液染色1－2分钟，自来水冲洗，气干。 14、镜检：低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。 注意事项 玻片完全干后，才可置油镜下进行观察。? 每次显带均应做予实验处理，以决定正确的显带时间，不可盲目处理所有玻片。? 显带效果的判断，应多观察几个长度适中的分裂相,不能仅凭1、2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间。 二、G显带标本的核型分析 2号染色体? 短臂：可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分为2个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带。? 长臂：可见6-7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4和第5深带之间的浅带为3区1号带。 3号染色体着丝粒染色浓。在短臂和长臂的中短各有一条明显而宽阔的浅带。? 短臂：一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征。此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带