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PAGE \* MERGEFORMAT4 引物设计的原理和程序 一、设计原理 1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。 2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。 3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。 4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。 5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。 6、引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。 7、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。 8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。 二、序列查找 根据所需检测的待检定基因，在 HYPERLINK /entrez/query.fcgi?db=Nucleotideitool=toolbar /entrez/query.fcgi?db=Nucleotideitool=toolbar网址查询有关序列。 三、引物设计与筛选 以Beacon Designer 5.1软件为例，进行引物设计和筛选。 1、打开软件，调入序列 2、选择序列文件名，加入右框 3、序列显示如图， 4、选择引物设计方式 5、点击“Primer Search（图标）”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻 6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页， 7、按照搜寻结果显示，逐条分析， 点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选 四、引物比对 比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在/BLAST/ 网址进行比对 1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr” 2、点击“Blast”，进入下一页 3、点击“Format”，进入比对结果