常见的试验四_人毛囊DNA的快速提取及PCR检测性别M.ppt

实验四 人毛囊DNA的快速提取 及PCR方法检测SRY基因判断性别 实验目的 掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理 掌握DNA的电泳检测技术 学习PCR扩增DNA的原理，掌握PCR操作步骤 掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理 试验内容 一 毛囊DNA的快速提取与检测 二 PCR扩增进行性别鉴定 前期准备 前期处理： 挑出毛发10根，尽量剪短至只剩下毛囊，去除毛根，放入干净的EP管中。 加入PH8.0的灭菌水清洗1-2次，离心后吸出水 PCR扩增进行性别鉴定 PCR试验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术之一。 PCR扩增产物检测 PCR扩增程序 95 ℃, 4min; 94 ℃, 30s; 60 ℃, 30s; 72 ℃, 30s; Go to 2 30循环 72 ℃, 5min; 4 ℃, 5min. 方法一 酚仿抽提法 试剂： 10% SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇 TE 10mmol/L Tris-Hcl, PH=8.0; 1mmol/L EDTA, PH=8.0 步骤 酚仿抽提法 优缺点： 该方法提取的DNA浓度不是很高，中间步骤过多会损失大量的DNA，所以如果是很细小的毛，并且量不多，不建议使用此方法。但是此方法提取的DNA质量较好，扩增效果好。 酚仿抽提法 图1. 酚仿抽提法检测结果 方法二、碱裂解法 于装有毛囊的EP管中加入0.2mol/L 的NaOH溶液 50μL，煮沸15min后，瞬时离心，吸取上清液至另外一只干净的离心管中 加入PH=6 左右的Tris –HCl 50μL，13000r离心2min 将上清液转移到另外一只EP管中即可。 方法二、碱裂解法 优缺点： 该方法提取步骤较简单，提取周期短，并且DNA损失量较少，提取效率高。 但 PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增。因此如果PCR扩增效率不高的引物，不建议用该方法提取。 方法三、PCR扩增法 试剂：10×PCR缓冲液、Mg2+、蛋白酶K(20mg/ml) 实验步骤： 按以下体系配制毛囊裂解液： 10×PCR缓冲液 100μL Mg2+ 80μL 蛋白酶K(20mg/ml) 1μL ddH2O 819μL 方法三、PCR扩增法 加入上述裂解液15μL于放有毛囊的EP管中 在PCR 仪上设置一个单循环程序: 65 ℃ 30 min , 95 ℃ 15 min , 4 ℃ 10min。 将上一步骤中的PCR 试管放入预热好的PCR 仪中,运行该程序； 吸取上清液于干净的EP管中即可； 方法三、PCR扩增法 优缺点：该方法提取DNA的效率较高，可获得较多的DNA，并且需要的毛囊量较少。较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA。 但是该方法抽提的DNA质量不是很好，扩增的时候需加大DNA加入量，并且扩增的结果中可能会有大量杂带。 图2： PCR法抽提检测结果 电泳检测 制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测 DNA具有结合EB分子的能力，在紫外灯下产生荧光的信号 二 PCR扩增进行性别鉴定 性别鉴定原理 人类男性的性染色体组成是XY，女性的性染色体组成是XX，因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因（如SRY基因）进行PCR扩增分析，即可对性别进行鉴定。 本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定，扩增呈阳性的为男性，扩增呈阴性的为女性。同时以常染色体上的GAPDH基因为阳性对照，男女皆能扩增出产物。 人类SRY基因的序列 用于性别鉴定扩增的引物序列 扩增退火温度：60 oC * 用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（DNA）进行电泳分离。 琼脂糖凝胶中有很多小孔隙，起一个分子筛的作用，DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙，DNA迁移速率与电场强度成正比，与DNA分子量大小成反比。从而将大小不同的DNA片段分离开来。 SRY PCR产物大小：501 bp GAPDH PCR产物大小：565 bp PCR扩增体系 10ul总体系： H2O 7 × 10 = 70 Buffer 1.0