《第四章目的基因的获取2007》精选课件.pptVIP

具体做法：将一个大的保护基团，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二环己基碳二亚胺（DCC）加到脱氧核苷酸的3`或5`羟基上。这样，具有5`-保护的单核苷酸，便能够通过它的5`-OP同另一个3`-保护的单核苷酸的3`-OH之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端都受保护的二核苷酸分子。 实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些可以通过碱处理移去。所以不论是5`-的保护基团还是3`-的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护作用而除掉。这样的一个带5`-保护的合成的二核苷酸分子，又能够同另一个带3`-保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 5.cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 6. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。 N= ln (1-p) ln (1- ) p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例 N：所需的重组载体数（克隆数） 1 n 1 n 7. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在 1、 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。 2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。 他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。 3、由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。 4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。 原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。 5、 cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究 一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定 8. cDNA文库与基因组文库相比的缺点 1、受材料来源的影响 2、遗传信息量有限 3、 构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少 三、文库的查询（screening） 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 目的基因的获取方法 1、直接分离法 2、基因文库分离法 3、PCR分离法 4、化学合成法 第三节 PCR扩增获得目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。 省时 省力 1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增 真核生物基因组含有内含子！ 适合扩增原核生物基因。 原核基因组部分 原核细胞 提取基因组DNA PCR扩增 （1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （4）PCR扩增 （3）根据目的基因序列设计引物 2. 从mRNA中扩增: RT-PCR 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。 适合扩增真核生物基因。 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的基因 的引物2 目的 基因cDNA第二链 PCR mRNA 值得注意的是常规PCR，可以合成的DNA片段长度有限，一般在1KB以内，大于他扩增效果显著下降。 ？ 未知序列的DNA 更长的DNA 特殊类型的PCR 1、套式PCR（nested PCR） 利用两对引物，从一个模板的同一区域扩增出不同长度而设计的特殊方法。他较常规PCR灵敏度大大提高，同时也能有较强的特异性。 2、不对称PCR 利用引物浓度不同（50：1或100：1）------单链DNA，用作DNA序列分析的模板。 3、反向PCR 未知序列的一种PCR方法 条件为：此未知序列的某侧序列必须已知 此外，还