PCR引物设计原理课件.ppt

PCR引物设计原理 变性 在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性温度在94-95℃下进行，这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。 有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模板 DNA 彻底变性的概率。 对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95℃ 变性45s。 引物和模板DNA 的复性 复性温度（退火温度）至关重要！！！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低； 退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增； 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 ℃下进行。 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。 引物的延伸与循环数目 对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78 ℃，时间约为1min。 引物设计要点 （1）碱基组成： GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。 （4）上下引物的互补性： 一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端都不能和 其他任何引物互补。 （5）解链温度（Tm 值）： 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为50-70℃。 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。 （6）3’末端 3’末端的性质非常关键。 如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A； 但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。 一些概念 有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链（anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand） Primer Premier 5.0 软件设计引物 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif BLAST 验证引物 进入http: ///BLAST/, 点击Basic BLAST中的 nucleotide blast 选项 Tm，退火温度窗口 Tm值曲线以选取72℃附近为佳； 5’到3’端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。 在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。 引物的长度及产物的长度设置。 Primer premier 5设计引物→Oligo引物评估 举例说明：ncbi里查找基因 LIF 的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS区序列。 Oligo不仅能以图表的方式将结果展示出来，还能以文本的形式保存。 在软件所出现的任何一个窗口，选择File→data As，把数据存为一个文本文件。 文本保存的结果如下： 最佳退火温度 最佳引物浓度、盐浓度 平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。 ΔG，序列内部碱基稳定性窗口 显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。 -1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6） ΔG值反应了序列与模板的结合强度； 最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 dA dC dG dT dA -1.9 -1.3 -1.6 -1.5 dC -1.9 -3.1 -3.6 -1.6 dG -1.6 -3.1 -3.1 -1.3 dT -1.0 -1.6 -1.9 -1.9 第二个核苷酸 第一个（5’）核苷酸 例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是： ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG） =-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol 显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。 3’末端序列ΔG太高。 你可以在三个窗口