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乙肝疫苗的制备 组员：一班 房天宇 李桦楠 二班 李耀 友情提示 此文档在网页中无法完全展示，请免费下载后阅读 乙型病毒性肝炎 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。 乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。 乙肝疫苗的概念 乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。 乙肝疫苗的发展史 乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。 1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿童，因为儿童的感染率极高。 2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品 疫苗的组成 疫苗的组成 抗原 免疫佐剂 乙肝疫苗的制备 目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。 乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带者的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血） 基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，都可以放心选用。 乙肝病毒病理切片 目的基因的 分离 培养酵母细胞（增） 检测正确表达目的产物的酵母（检） 0.0 重组酵母构建 重组质粒的构建（切，接） 导入酵母细胞（转） 转 细胞转化手段将DNA 重组分子导入酵母细胞内。 增 短时间培养转化酵母细胞，以扩DNA 重组分子。 检 检 接 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成 DNA重组分子。 根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的 基因。 用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质粒分子切开。 切 筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌 菌种制备和发酵 用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。 发酵过程应该具有下列特点： 原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行 大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。 发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。 可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。 分离纯化 细胞破碎 微滤 超滤 微滤 超滤 硅胶吸附 疏水层析 硫氰酸盐处理 凝胶层析 离子交换层析 无菌过滤 无菌过滤 氢氧化铝共沉淀 细胞破碎 微滤  超滤  发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。 细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。 滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦