Western-Blot本原理及操作.pdfVIP

Western Blot基本原理及操作 中山医院临床医学研究院 侯嘉云 hou.jiayun@zs-hospital.sh.cn Michael A. Milhollen, cancer research, 2011 流程 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白提取 蛋白定量 蛋白定量 • 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 • 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、 突出ppt展现内容为主。 样品准备 样品制备过程中的一些要点与建议 • 收集细胞离心时转速需适当； • 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子； • 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变，制备过程应在低温进行； • 样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直 接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反 复冻； • 煮样时防止爆管 分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶制备-分离胶 灌制分离胶 隔绝空气 ddH O 2 0.1%SDS:8% 异丁醇：8% 浓缩胶(5%) 凝胶制备-积层胶 灌制积层胶 插入梳子 制备凝胶中的要点 • AP要新鲜配制； • 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合，导致电泳带畸 形，太慢不均匀； • 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间； • 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬， 从而电泳时易烧胶 • 保持所有装置清洁； • 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存 凝胶电泳 上样的注意要： • 20--50ug总蛋白 或100ng纯蛋白， 可根据蛋白表达水 平进行优化； Staking gel • 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样， 体积尽量一致； Separating gel • 样品两侧的及空 置的泳道用等体积