单增李斯特菌溶源性噬菌体的分离鉴定及部分基因功能研究-预防兽医学专业论文.docx

万方数据 万方数据 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文《单增李斯特菌溶源性噬菌体 的分离鉴定及部分基因功能研究)) ，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 : 军芳哼 日期: 乞创叶年 1月 (0 日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一-年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 / 不保密囚d (请在以上方框内打(( .J ) 学位论文作者签名 :是慧 指导教师签名 : 2 伍尖 日期:w l 千 年 !月(0 日 日期: t01今年 f 月 (0日 万方数据 一_- - 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 单增李斯特菌溶源性噬菌体的分离鉴定及部分基因功能研究 摘 要 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是一种重要的人兽共 患病原菌,噬菌体是一类专一寄生的细菌病毒,具裂解循环或溶源循环。 PCR 及其扩增产物的序列测定显示 38 株单增李斯特菌分离株中的 16 株在 tRNAArg 位点携有原噬菌体，利用丝裂霉素 C 诱导获得一株溶源 性噬菌体，透射电子显微镜观察表明该噬菌体为长尾噬菌体，命名为 W001，DNaseI、RNaseA 和绿豆核酸酶消化噬菌体基因组的结果确认 其核酸为 dsDNA。鸟枪法测定 W001 基因组序列，run-off 法确认其基 因组末端具有 COS 位点 5’-CGGTGTGGGG-3’, W001 基因组全长为 42，227 个碱基，由 66 个开放阅读框组成，噬菌体整合核心序列 attPP’-AATCCCTCTCAGGACG 位于噬菌体整合酶下游。 第 20 个开放阅读框编码全长为 281 个氨基酸的噬菌体裂解酶 PLYW001，该酶由 NH2 端的催化结构域（Enzymatically Active Domain， EAD 和 COOH 端的结合结构域（Cell-wall Binding Domain，CBD）组 成,利用大肠杆菌表达并制备裂解酶，Ni 柱纯化，Bradford 法定量裂解 酶蛋白浓度，浊度递减法测定 PLYW001 的裂解活性和裂解谱， PLYW001 可裂解包括噬菌体 W001 宿主菌 HA1073、EGDe、10403s 在内的 1/2a 血清型的单增李斯特菌；氨基酸替换突变研究结果显示位 于裂解酶 PLYW001 催化结构域的 7 个氨基酸（45R、50Q、64S、66H、 73D、115D 和 118H）与裂解酶活性相关。 PCR 分别扩增 EGFP 和裂解酶 CBD 编 码 基 因 ， 构 建 载 体 pET28a-EGFP-CBD，大肠杆菌表达融合蛋白 EGFP-CBD，Ni 株纯化 制备 EGFP-CBD，激光共聚焦显微镜观察证明 CBD 可结合于单增李斯 特菌细胞壁。 在整合酶作用下，噬菌体基因组 DNA 以 attPP’位点特异性整合 I 至宿主细菌基因组 DNA 的 attBB’位点。利用噬菌体 W001 的整合酶 构建非李斯特菌复制型质粒 pHAL2，并电转化 actA/plcB 缺失的单增 李斯特菌 LM-1003 感受态细胞，PCR 扩增产物的序列测定表明该质粒 成功整合至 LM-1003 基因组特异性 tRNAArg 位点，因此，质粒 pHAL2 可用于基因敲除菌株的基因互补。 关键词：单增李斯特菌；噬菌体；裂解酶；整合酶 II ISOLATION, CHARACTERIZATION AND FUNCTIONAL STUDY OF PARTIAL GENES OF LYSOGENIC PHAGE W001 OF LISTERIA MONOCYTOGENES ABSTRACT Listeria monocytogenes is an important zoonotic pathogen. phage is a virus that can specifically infect bacteria, and may have a lytic cycle or a lysogenic cycle. The results of