小麦茎尖生长点转化技术-研究.pdfVIP

小麦茎尖生长点转化技术研究 1引言 小麦不仅是重要的粮食作物、工业原料作物，还是我国北方农区最重要的生态覆 因、以Bar为筛选标记，利用基因枪法将其导入小麦品种Pavon的未成熟胚，获得了 GUS阳性愈伤组织，从中再生出了抗除草剂Basta可结实的转基因植株，并获得了转 基因的种子(TI)，开创了小麦转基因的第一个成功实例。此后，许多研究者借鉴其 做法，用其他的品种和外源基因进行小麦转基因研究也都获得了成功【2-l¨。随着农杆 菌法在禾本科植物转基因应用上的突破【12。141，后来小麦的农杆菌法转化也获得了成功 115]。受小麦本身一些特性的影响，尽管人们对小麦的转化方法做了大量研究，但是小 麦的转基因还依然存在着很大的问题。目前，小麦的转基因技术还很不实用、很不成 熟，发展成熟、实用的转基因技术仍然是今后小麦转基因研究的重要内容。 虽然小麦转基因研究与应用取得了较大的进展，但是还存在着很多问题。总结回 顾小麦转基因研究的历程、分析其中存在的问题、找出应努力的方向，对推进小麦转 基因研究与应用的进一步发展具有重要意义。 1．1小麦基因转化研究的基本历程与存在问题 从广义上讲，植物转基因研究是建立在细胞全能性的表达和DNA体外操作以及二 者结合基础上的，其基本历程是细胞培养技术、DNA操作技术、遗传转化技术发展的 历程。从狭义上讲，植物转基因主要是指植物的遗传转化。小麦是世界上第一大作物， 所以在人们一开始提出转基因概念的时候就想到了小麦的遗传转化。但由于小麦的组 织培养，特别是原生质体培养难度很大，早期的小麦转基因研究主要是组织和细胞培 养技术的发展与改进。植物遗传转化的方法很多，Portrykus曾将其归纳为17种n引， 后来人们又有了很多扩展和补充【…卜例。追寻这些方法的实质，主要可分为三类：直接 转化法、农干菌转化法和自身机制法120l。 1．1．1直接转化法 直接转化法包括：以原生质体为受体的电击法、PEG法、脂质体法，以细胞、细 胞团或小愈伤组织为受体的电击、激光、超声波、离子束、碳化硅等破壁或打孔以及 基因枪法等。 最初被视为理想的遗传转化受体的是原生质体，因此小麦的遗传转化研究最早是 把关注点放在原生质体培养技术的突破上。早在1969年人们就开始Y4,麦的原生质体 分离与培养研究，当时世界上有许多实验室，如美国的Vassil、德国的Lorz、英国的 洛桑实验站等都关注着小麦原生质体培养。但此难题直到1988年才被攻克，当年世界 上有三个实验室分别独立地将小麦原生质体率先培养成功：Harris等用春小麦品种 河北农业大学硕士学位(毕业)论文 “Chri s的花药愈伤组织分离原生质体，再生出了原生质体植株f2】】；王海波等用栽 培品种“徐)H211”成熟胚愈伤组织建立的悬浮细胞系游离原生质体【22-231，再生出了 小麦原生质体植株；任延国等用小麦幼穗愈伤组织游离原生质体，再生出了原生质体 植株。三家报道中，王海波等以小麦栽培品种成熟为起始体诱导愈伤组织，并通过继 代进行质量改进获得了胚性愈伤组织，用胚性愈伤组织成功地建立了小麦悬浮细胞 系，进而用悬浮细胞系分离原生质体进行培养，被同行专家公认为“最成熟的小麦原 生质体培养技术。此后，人们利用小麦原生质体做受体进行了遗传转化研究。1993 年，杨书礼、曾君祉等用原生质体做受体将抗除草剂基因和荧光素酶基因转入小麦再 生转基因愈伤组织【241。同年，朱祯等以原生质体为受体，利用脂质体介导法将含HP，I’ 基因的大肠杆菌质粒pCGNl055转入小麦原生质体，筛选后获得了3．8％的抗性克隆， 转入分化培养基后再生了白化斟25】；郭光沁等以原生质体为受体，用PEG法将GUS基因 体为受体，用电击法进行转化，获得了具有除草剂(PPT)抗性的植株，但这些植株 未结籽【271。产生白化或出现不育的问题，可能是由于用来制备原生质体的细胞系继代 次数太多或培养时间过长所致。鉴于原生质体培养不仅操作程序复杂、难度大，而且 易导致无性系变异，给不少研究者造成了心理恐惧，后来许多转基因的工作一直回避 采用这一技术。不过，要想在植物上实现真正的基因打靶，原生质体将是不可回避的 转化受体。 基因枪法是借鉴枪的原理将带有目的基因的微弹打入培养细胞或组织进而获得 转基因植株的方法。具体做法是：将目的基因(DNA)包被在直径1微米左右金粉或钨 粉上，然后通过火药爆炸、或高压放电、或高