实验八 红细胞融合.pptVIP

实验八 鸡红细胞融合实验 一、实 验 目 的 1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 理解体细胞融合原理 2. 掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术，并观察细胞融合过程。 二、实验原理 细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。 目前, 诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) (Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980)。 PEG能改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起两个细胞邻接位置的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 三、实验用品 1 器材： 离心机，水浴锅，普通光学显微镜；量筒，滴管，刻度离心管，等。 2 材料 ：新鲜鸡血 3 试剂 Alsever液，葡萄糖2.05g，拧棱酸纳0.8g，氯化纳0.42g。加重蒸水至100mL 。 0.85%生理盐水 ， GKN液：氯化钠8g，氯化钾0.4g，磷酸氢二钠1.77g，磷酸二氢钠0.69g，葡萄糖2g，酚红0.0lg，溶于1000mL重蒸水中。 Ringer溶液：氯化钙0.25g，氯化钾0.42g，氯化钠6.5g(恒温动物8.5g)，溶于1000mL蒸馏水中。 Hanks液：氯化钙0.14g（另溶解），氯化钾0.4g，磷酸二氢钾0.06g，氯化镁0.10g，氯化钠8.0g，碳酸氢钠0.35g，七水磷酸氢二钠0.09g，D-葡萄糖1.0g，酚红0.01g。按顺序依次逐一完全溶解，用时氯化钙和其余混合，共计100mL。 50%PEG混合液：称取适量PEG(4000)放人刻度离心管沸水浴中加热溶化，待冷却至50℃时，加入预热至50℃的等体积的GKN液，混匀。注意使用前配制，PGE有毒避免沾染皮肤。 四、 实验步骤 将Alsever液与新鲜鸡血4:1混成悬液 （抗凝效果最佳） ↓ 取上述悬液按 1:4 加入生理盐水混匀 ↓ 1500r/min，离心5分钟（重复洗涤2次，去除细胞表面粘附物质） ↓弃上清 加入适量GKN液，配成细胞悬液（10% ） ↓ 取悬液以血球计数法计数 （红细胞 15万~20万个/ml，可用GKN稀释 ） ↓ 加入 50%的PEG液混匀（1mL悬液，逐滴加入0.5~0.8mL预热的50%PEG混匀，置于37℃水浴中温浴2~10min； ↓加 Ringer或Hanks终止 吸取1~2滴镜检（加0.2%次甲基蓝1滴 ），并计算出融合率 五、 实验结果 经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。绘图说明各个时期。细胞融合后可观察到哪几种类型的细胞？ 细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。多个视野计数再平均 六、讨论 血细胞悬液密度与融合率的关系？ 查阅近期资料，了解如何提高融合率？ 本实验为什么用鸡血？ * * * * 融合通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 经有丝分裂后，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。