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海水鱼类精液超低温保存技术及; 质量检测规范 中国科学院海洋研究所海洋生物种质库 联系人：李军研究员 中国青岛市南海路7号，266071 电话:0532内容目录: TOC \o 1-5 \h \z 鱼类精液超低温保存的重要意义 1 HYPERLINK \l bookmark2 \o Current Document \h 海水鱼类精液超低温保存方法 2 HYPERLINK \l bookmark3 \o Current Document \h 真鲷生物学特性经济价值 3 HYPERLINK \l bookmark4 \o Current Document \h 海水鱼类精液超低温保存技术 4 新鲜精液的采集 4-1 新鲜精液质量的鉴定 4-2 精液与抗冻液混合，分装 4-3 降温速率的控制 4-4 解冻温度的控制 4-5 冻精质量检测 4-6 HYPERLINK \l bookmark0 \o Current Document \h 海水鱼类精液超低温保存质量规范 5 解冻后精子活力状况 5-1 解冻后精子受精率，孵化率 5-2 解冻后精浆特殊酶活性检测 5-3 解冻后精形态结构及功能的检测 5-4 解冻后精子DNM员伤的检测 5-5 鱼类精液超低温保存的重要意义 目前已经有40多中海水鱼的精液成功的得到保存，鱼类精液的超低温保 存的意义主要有以下几点： 为水产养殖业的发展开拓了广阔的前景 (1 )利用低温保存技术保存鱼类的精液可以解决甶于雌雄鱼性腺成熟不同步 或地理分布不同产生的得生殖隔离导致人工繁殖困难； 扩大杂交育种的范围，培养新品种，发挥杂种优势，克服长期近亲交配 造成的种的衰退；使性转换的个体得以自交； 提高精液的利用率，扩大苗种生产，尤其是对精液难以获得或获得量较 少的种类； 为鱼类的疾病史的研究提供了材料，促进鱼类病理学的发展； 使精液的运输更为便利，为繁殖育种节约大量的资金。 为种质资源的保存和生物多样性的保护开辟了新途径 鱼类精液的低温保存技术，可将珍稀、濒临灭绝的优质、经济、价值高 的品种的鱼类的精液长期保存，(200—32000年)，以解决由于过度捕捞，生 态环境破坏以及长期近亲交配和小群体繁殖所产生的基因丢失和遗传嬗变导 致的种质的退化等现象。 为鱼类的遗传育种和现代生物技术的研究不间断的提供生物材料 海水鱼类精液超低温保存方法 目前海水鱼类精液超低温保存方法主要有一下两种方法： ⑴程序降温法：利用低温程序降温仪，按照预设的程序进行降温，然后将样 品保存到液氮中。 优点：程序性降温，精确，稳定； 缺点：仪器昂贵，成本高； 适用范围：适用于实验室用，少量样品的保存供给生物科学研究。 ⑺分步降温法：利用装有液氮的容器(液氮罐，或聚乙烯泡沬箱)，通过控制 样品距离液氮面的高度调整降温速率，然后将样品保存入液氮中。 优点：操作简单，成本低； 缺点：降温控制不稳定； 使用范围：适用于工厂化应用 海水 鱼类精液超低温保存因种 °的差别导致其具体的保存技术差别很大，下 面主要以真鲷精液超低温保存为例详细介绍海水鱼类精液超低温保存技术 及其质量检测规范。 真鲷生物学特性，经济价值 真鲷(Pagrosonws major )属脊椎动物门，鱼纲、鲈形目、鲤科。分布 于印度洋和太平洋西部。在我国黄、渤海均有分布。生殖季节，雄鱼体色发 黑，雌鱼体色发红，极易区分。 真鲷是近海暖水性名贵底层鱼类，是我国海水鱼养殖的重要对象，其肉 质细嫩，味道鲜美，体色艳丽，具有很高的经济价值。由于近年过渡捕捞， 环境污染，真鲷资源出现衰减，产量下降。 海水鱼类精液超低温保存技术 新鲜精液的采集 将体色明显的雄鱼捞出水池，0.003-0.005%丁香酚麻醉5min ；鱼体 用蒸馏水冲洗数次，将体表擦净；生殖孔蒸馏水冲洗数次，擦净；轻轻 挤压腹部，成熟的精液自然流出，采集至干净的玻璃器皿中。通过人工 轻轻挤压腹部采集精液是最常用的方法，注意在采集精液时要防止海水、 血液、体表粘液、尿液、粪便等的污染。 新鲜精液质量的鉴定 取适量精液海水激活镜鉴精子的活力状况，对于一般海水鱼类，成 熟的精子激活后应立即作快速的直线运动，或涡旋运动。活动率在80% 以上的精液方可进行超低温保存。将采集的精液置于0 -4 丁条件下， 精液与抗冻液混合，分装 精液超低温保存过程中抗冻剂、稀释液(合称抗冻液)的选择起着 极为关键的作用。实验证明Hank s , ringer , cortland等稀释液与亚砜 二甲基(DMSO ),乙二醇(EG ),丙二醇(PG )配成的抗冻液在真鲷精 液的超低温保存有很好的保护效果。 下面以Hank s + 15%DMSO作为抗冻液为例，其步骤如下： 抗冻液的配置：Hank s 配方：NaCl 8.01 ；