抗血的制备.pptVIP

医学检验系临床免疫学教研室;实验原理 在抗原刺激下可以使机体产生相应的抗体，由于抗体通常存在于血清中，因此也将机体受到抗原刺激后的血清称为免疫血清，免疫血清中含有对应于该抗原的多个决定簇的多种抗体—即多克隆抗体。;实验原理 抗血清的制备分为三个步骤： 抗原的制备与纯化 动物的免疫（注射途径、注射次数、间隔时间等） 血清分离纯化与效价鉴定 ;试剂与器材 抗原与免疫对象 细菌菌种（伤寒沙门菌O901）、健康家兔。 试剂 生理盐水、麦氏比浊管、石炭酸、防腐剂（0.02%叠氮钠或0.01%硫柳汞）等 设备与器材 剪刀、镊子、注射器、试管等器材和冰箱、离心机等设备;实验方法 伤寒杆菌O抗原的制备 取经革兰染色做细菌纯度鉴定的伤寒沙门菌，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24～48小时； 用生理盐水将细菌菌苔洗于清洁、无菌的三角烧瓶中，置60℃水浴或隔水煮沸1小时使细菌的菌毛破坏（破坏H抗原）；;3. 将菌液移入离心管4000r/min离心10min，弃去上清，并用无菌生理盐水洗涤2次； 4. 取少量处理过的菌液再次接种于琼脂平板上进行无菌实验（37℃，24h），确定无活菌后用生理盐水调整菌液浓度至109个/ml，加石炭酸至终浓度为0.5%，即为细菌O抗原。 ;实验方法 伤寒杆菌H抗原的制备 取有鞭毛的伤寒杆菌密集划线接种于普通琼脂平板上，37℃培养24～48小时； 取出培养板，用含有5%石炭酸（苯酚）的生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，移入无菌三角烧瓶中，置37℃水浴24h（或4℃3～5天固定杀菌）； 做无菌试验，用生理盐水稀释成10*9个/ml，即为细菌H抗原。 ;;实验方法 抗血清获取 试血：末次免疫7d后试血，试血一般耳静脉或心脏采血，分离血清与伤寒沙门菌O或H抗原做试验管凝集试验，凝集效价（滴度）在1：1600～3200之间时即可以放血，若效价较低，可继续加强免疫； 放血：采用心脏采血以获得最大血量，置37℃促进血块收缩，并用吸管吸取血清，3000r/min离心10min去除残余的红细胞。 ;实验方法 抗血清的鉴定 效价的测定 效价的测定可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单项免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶免疫测定及放射免疫分析等方法进行测定。本实验以凝集反应为例。; 特异性测定 抗体的特异性通常以交叉反应率表示,交叉反应率可以用竞争抑制试验测定。 亲和力测定 亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。;实验方法 抗体的保存 抗体的保存浓度为20～30mg/ml为宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下低温保存。; 思考与讨论 动物的选择 免疫方案的确定