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慢病毒载体构建及包装操作手册 目录 慢病毒收到后的注意事项 一、 整体实验流程 二、 实验材料 三、 慢病毒包装和浓缩 四、 感染目的细胞 附 1. 汉恒生物慢病毒质粒列表 附 2. 慢病毒滴度测定方法简介 附 3. 慢病毒 MOI 感染参数 附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较 汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册 慢病毒安全使用和注意事项 ➢ 慢病毒安全使用注意事项 （*非常重要！！！* ） 1) 慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。 2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3) 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70% 乙醇加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液 请于 84 消毒液浸泡后统一处理。 4) 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。 5) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。 6) 实验完毕用香皂清洗双手。 ➢ 慢病毒收到后的注意事项 1) 慢病毒的储存 用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4 ℃保存 （尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。 注：a ．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50% ）；在病毒使用过程中应尽量 避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube ），收到后直接放置-80℃保存即可。 b ．如果病毒储存时间超过6 个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。 2) 慢病毒的稀释 汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册 用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用 PBS 或无 血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(请尽量一周内用完)。 汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册 一、 整体实验流程 二、 实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 psPAX2, pMD2.G, pHBLVTM 系列质粒。 1、载体信息（见附表 1 ） 2、细胞株 ：我们采用 293T 作为慢病毒的包装细胞。该细胞系为贴壁依赖型成上皮样 细胞，生长培养基为 DMEM+10% FBS+双抗。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 ：大肠杆菌菌株 DH5α 用于扩增辅助包装载体质粒 ；Stbl3 用于扩增 pHBLVTM 系列质粒，防止病毒载体重组。 三、 慢病毒包装和浓缩 (一) 质粒扩增 汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册 构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1 g/l ，A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以病毒包装。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提 （质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。 (二) 做脂质体转染 6 转染前一天，按照 510 /T75 的密度铺下 293T细胞。24h后转染。转染前请把 DMEM 和转染试剂 LipoFiterTM 恢复至室温，使用前需摇匀。转染每瓶 T75 的质粒成分如下： psPAX2 10 μg PMD2.G 10 μg pHBLVTM 系列载体 10 μg 请参考 LipoFiterTM 转染试剂说明书进行转染操作。转染后 6 h 换新鲜培养基。 注：LipoFiterTM 转染试剂为汉恒生物研制的 DNA 转染试剂