微透析技术—同位素示踪法联用进行青藤碱贴剂的皮肤局部药.docVIP

微透析技术—同位素法进行青藤碱贴剂的局部药动力学研究zyfeng-2006@163.com ； 【基金项目】国家自然科学基金资助项目)；中国博士后基金资助项目（20070420509） 药后青藤碱在皮肤皮下组织的药物浓度，研究其在皮肤深层的局部药动学，为以经皮给药为代表的局部药动学研究提供借鉴。 1 实验材料 1.1 药品与试剂 青藤碱：中国药品生物制品检定所（批号：0774－200105）； H3-青藤碱：北京原子高科股份有限公司采用同位素气液催化交换法标记完成（浓度1.0mCi·mL-1，放射性活度2.0mCi，放射性比活度2mCi·mg-1，放射化学纯度95％，溶解于无水乙醇中）；闪烁剂：PPO(E.Merk公司生产)、POPOP（KOGrLight公司生产）；NaCl、CaCl2、KCl、乙二胺均为分析纯。 1.2实验动物 健康SD大鼠，♂，清洁级，体重（300±20）g（广州中医药大学动物实验中心提供，许可证号SCXK粤2003-001）。 1.3仪器 PE1450液闪计数器（芬兰PE公司）；戴安SummitP680型高效液相色谱仪，包括p680泵、UVD170U可变波长紫外检测器、Chromeceon色谱工作站。 2 方法 2.1 HPLC检测青藤碱分析方法的建立 2.1.1 色谱条件　色谱柱：大连依利特Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水(50:50，V/V)，加入的0.2%乙二胺作为改性剂，流速为1mL·min-1，检测波长为265nm，柱温为室温。 2.1.2线性关系考察　 精密称取P205干燥24h至恒重的青藤碱标准品7.50mg，置于25mL容量瓶中，甲醇定容，振摇即得浓度为0.30mg·mL-1的标准品贮备液。分别吸取0.5,1,2,4,6,8,10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。 2.1.3精密度实验　青藤碱标准品在1d内连续进样5次，每次进样10μL，并分别在连续5d内每天进样一次，每次进样10μL，考察日内精密度和日间精密度。 2.1.4稳定性实验 将用于测定相对损失率的皮肤微透析样品在0,2,4,6,8,16h分别进样5 μL，记录峰面积。 2.1.5阴性干扰实验　分别称取8.599gNaCl、0.144g CaCl2 0.298g KCl溶解于蒸馏水中,并定容至1000mL，用0.45 μm的水系微孔滤膜过滤即得林格氏液（Ringer’s液）。分别吸取10 μL的空白林格氏液、标准品液、标准品+林格氏液、微透析样品注入高效液相色谱仪中，对比色谱图，观察在青藤碱出峰位置是否存在干扰。 2.1.6　检测限与定量限　分别配制不同浓度的标准品溶液，分别进样10μL，按S/N＝3计算检测限，按S/N＝10计算定量限。 2.2 微透析-放射性同位素示踪法进行含H3-青藤碱的青藤碱贴剂局部药动学研究 2.2.1含放射性 H3-青藤碱的青藤碱贴剂制备 精密取放射量为0.5毫居里H3-青藤碱与藤碱混和后按青藤碱贴剂制备方法制备含有H3-青藤碱的贴剂SD大鼠后腹部植入线性微透析探针μL·min-1的灌流速度灌流空白林格氏液，连续收集100μL，μL，加入水性闪烁剂1mL，进行五分钟内衰减计数（dpm）作为液闪计数仪的本底。 2.2.3皮肤微透析探针相对损失率（Relative Loss,RL）的测定[3] SD大鼠麻醉后腹部植入线性微透析探针，平衡1h后以1μL·min-1的流速灌流林格氏液20min为采样间隔，μL，共收集3份测定青藤碱的相对损失率RL。（式一） 2.2.4 在体大鼠皮肤微透析实验 在测定大鼠在体皮肤相对损失率2h后将贴剂贴敷于大鼠腹部，以相同的流速灌流林格氏液、以相同的采样间隔采样μL，连续20hμL微透析样品，准确加入1mL水性闪烁液，每份样品测定5min，采用液闪计数仪测定放射性强度并经校正（式二） 图1：青藤碱贴剂皮肤微透析示意图 2.3数据处理 以皮肤微透析样品浓度（以放射性强度表示， Cdialysate，dpm）对采样间隔的时间中点作图μg）进行线性回归，得回归方程A=13.528*x-0.368(r=0.9999)，进样量在0.15～3.00μg之间呈良好的线性关系。HPLC 检测限约为1.5ng，定量限约为4ng。 3.2青藤碱的HPLC色谱行为及专属性 在上述色谱条件下，青藤碱出峰位置无吸收峰出现，杂质峰与青藤碱得到良好分离，分离度佳，具有良好的专属性，分析方法可行。结果见图2。 A B C D 图2 青藤碱HP