SARSCoV冠状病毒M蛋白作为一类新的胞内病原相关分子模式上调Ⅰ型干扰表达.docx

北京协和医学院 北京协和医学院 博士研究生学位论文 (十三)IFN—B ELISA干扰素酶联免疫吸附实验 ．46 (十四)VLP孵育实验 ．．47 (十五)免疫荧光实验 ．47 (十六)蛋白免疫共沉淀CO—IP实验 48 实验结果 ．51 一SARS．CoV冠状病毒M基因诱导HEK293T细胞干扰素基因表达 上调 5 1 二SARS．CoV冠状病毒M基因激活IFN．B信号通路依赖于TBKl、 IRF3 ．．55 三SARS．CoV冠状病毒M基因在HEK293T细胞系中更倾向于激活 TLR介导的信号通路 59 四SARS．CoV冠状病毒M基因与TLRs受体通路中Myd88、TRAM 衔接蛋白相互作用检测 ．61 五SARS．CoV冠状病毒M基因在小鼠永生化骨髓巨噬细胞中通过 靶向TLR受体介导的相关通路活化IFN．p表达通路 62 六SARS．CoV冠状病毒M基因对A549细胞及Vero细胞干扰素p启 动子表达的影响 ．65 七SARS．CoV冠状病毒M基因通过蛋白水平发挥诱导IFN．B表达的 作用 66 八SARS．CoV冠状病毒M蛋白泛素化修饰探究 ．69 九SARS．CoV冠状病毒M蛋白可作为胞内的病原相关分子模式激 活IFN．D的表达 ．73 十SARS．CoV冠状病毒M蛋白诱导IFN—p产生并不依赖于TRAF3 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．’76 十一SARS—CoV冠状病毒携带M突变体(V68A)不能诱导感染细 胞IFN．p的表达 ．80 十二SARS．CoV冠状病毒M蛋白缺失突变体对HEK293T细胞干扰 素p启动子表达的影响 82 讨论 84 小结 88 参考文献 ．89 万方数据 北京协和医学院 北京协和医学院 博士研究生学位论文 文献综述 ．93 天然免疫系统中的模式识别受体 93 发表文章 1 19 致谢 ．120 万方数据 北京协和医学院 北京协和医学院 博士研究生学位论文 中文摘要 天然免疫反应是机体抵抗外源性病原体入侵感染的第一道防线。天然免疫系 统主要通过受染细胞中的模式识别受体(PRR)来识别病原体来源的病原相关分子 模式(PAMP)。大部分的模式识别受体位于细胞膜或内体膜上以识别病原体相关 的RNA、DNA或者人工合成的双链RNA类似物如polyI：C，同时还有一些模式 识别受体游离存在于细胞质中，识别病毒的DNA核酸。然而，目前对于侵入细 胞内病原体所释放出的蛋白质是否可以作为一类胞内的病原相关分子模式 (PAMP)来发挥激活先天免疫反应作用还不是很清楚。实验室前期的研究发现， 在HEK293细胞中，转染严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS．CoY)编码的M基 因可以诱导I型干扰素(D干扰素)表达上调，然而具体机制并未得到深入的研 究。在本论文研究中，我们发现转染SARS．CoV冠状病毒M基因可以上调 HEK293T，HEK293ET以及永生化小鼠骨髓巨噬细胞J2一Mtpqb IFND的基因表达， 但在A549和Vero细胞中，M基因未能上调IFNp启动子的表达水平，说明M基 因上调IFNl3的现象可能具有组织细胞特异性。并且M基因同时激活了诱导I型 干扰素表达的TBKl．IRF3以及NFlcB信号通路。通过构建M基因不翻译的突变 M．stop，并与正常M蛋白表达质粒进行功能比较，结果发现是M蛋白而不是M 的mRNA诱导IFND的基因表达。此外，对干扰素表达通路中上游信号分子进行 系统检测，发现M蛋白激活IFNl3的基因表达与TLR受体通路中的衔接蛋白 MyD88，TIRAP和TICAM2相关，而并没诱导激活RIG．I和MDA5介导的信号 通路。我们还通过免疫共沉淀的方法检测了M蛋白与TLR受体通路MvD88和 TRAM衔接蛋白的相互作用，结果为阴性，说明M蛋白可能通过间接的方式调 控了TLR受体通路的衔接蛋白。由于蛋白表达实验中发现M蛋白的条带有拖尾 现象，我们试图检测M蛋白是否可能发生了泛素化修饰，通过突变其预测可能 发生泛素化的赖氨酸位点并构建突