利用微流控芯片研究缺氧环境中lncrna h19在间充质干细胞介导的乳腺浩癌转移中的作用及机制.docxVIP

目 目 录 一、摘要 。1 (一)中文摘要 ．1 (二)英文摘要 ．．5 二、正文 10 (一)前言(一)日U舌 ．1010 (二)材料和方法 12 (三)结果 ．20 (四)讨论 ．32 (五)结论 ．．34 (六)参考文献 ．35 三、综述 38 (一)综述 38 (二)参考文献 ．．43 四、致谢 ．．47 万方数据 大连医科大学硕士学位论文利用微流控芯片研究缺氧环境中LncRNA 大连医科大学硕士学位论文 利用微流控芯片研究缺氧环境中LncRNA H19在间充质干细胞 介导的乳腺癌转移中的作用及机制 摘要 目的：乳腺癌在我国乃至全世界均位居女性恶性肿瘤前列，严重威胁女性健 康。研究显示，2010年至2015年我国女性乳腺癌的发病率、病死率及患病率呈继 续增长态势，因此控制、治疗乳腺癌的发生、发展刻不容缓，寻找治疗乳腺癌的 靶点至关重要。 长链非编码RNA(10ng noncoding RNA，lncRNA)是指长度在200—1 00000 nt之 间并且不编码蛋白质的RNA分子，但它参与细胞内多种过程的调控。其中H19 基因全长2．5kb，共有5个外显子及4个内含子，H19基因产物加工生成的成熟 H19全长为2．3kb，因缺乏明显的开放阅读框，被称为非编码RNA。虽然在细胞质 及细胞核内都能检测到H19 RNA分子，但H19 RNA主要存在于细胞质内，以调 节性RNA或核糖调节子的方式发挥功能。 转移是恶性肿瘤危及生命的最主要生物学特征，它的出现，则标志着肿瘤发 展的关键转折。远处转移一旦出现往往意味着肿瘤进入晚期阶段，单凭局部治疗 己难以达到治愈目的。在临床治疗过程中，仍有近1／3的患者在明确恶性肿瘤诊断 之初，就已经有远处转移。对于相当比例的实体恶性肿瘤患者，一旦发生转移， 通常意味着临床预后不佳。因此，对于侵袭与转移全过程的细致分解，有助于未 来设计更加理想的肿瘤标志物，对恶性肿瘤的早期诊断、早期治疗有重要意义。 由于恶性实体瘤生长快，实体瘤所在的环境产生缺氧及酸性增加，肿瘤细胞 可能会快速对抗缺氧和酸性环境，调节细胞内外pH值以及分泌血管生成因子，刺 激血管内皮细胞增殖和游走运动，从而诱发新生血管生成并促使肿瘤能得到充足 的血液和氧气，为向周围组织侵袭创造条件。在众多复杂的外部因素之中，缺氧 是促进恶性肿瘤细胞向外生长、耐受凋亡的微环境变化。细胞对缺氧的反应包括 增加缺氧诱导因子．1ct(HIF．1s，hypoxia inducible factor-10t)转录复合物的稳定性， 继而促进血管生成、无氧代谢、细胞生存和侵袭。 问充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有较强再生功能和免疫 调节功能的基质细胞，同时也是骨髓中造血干、祖细胞重要的支持细胞，通过分 万方数据 大连医科大学硕士学位论文泌多种细胞因子来支持造血。MSCs是肿瘤基质的重要组成成分，也被视为肿瘤相 大连医科大学硕士学位论文 泌多种细胞因子来支持造血。MSCs是肿瘤基质的重要组成成分，也被视为肿瘤相 关成纤维细胞的前体。研究显示，MSCs与多种免疫细胞，如T细胞、B细胞、树 突状细胞(dendritic cell，DC)、单核巨噬细胞以及自然杀伤(natural killer，NK)细胞 之间存在着相互作用。有实验表明，MSCs可通过分泌大量的细胞因子吸引更多的 单核细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞，从而影响肿瘤的生长。 微流控芯片由微通道构成网络，以可控流体贯穿整个系统，用来取代常规生 物化学实验室。它可以把样品制备、反应、分离等微缩到一块芯片上，具有高通 量、集成化、可调控、易操纵的优点，是用于模拟微环境进行肿瘤转移研究的有 利平台。微流控芯片目前使用的高分子有机硅化合物聚二甲基硅氧烷 (polydimethylsiloxane，PDMS)等材料具有良好的生物相容性及对氧气和二氧化 碳的通透性。细胞培养、刺激、分选和裂解等过程都可以在芯片平台上实现。微 流控芯片已经成为细胞生物学研究领域极为重要的研究平台。将不同细胞在微流 控芯片中共培养，从而能更好地研究细胞间的相互作用，该方法在肺癌细胞和巨 噬细胞中均已报道。 在本项研究中，我们利用微流控芯片技术，去探究缺氧环境中，LncRNA H19 在间充质干细胞介导的乳腺癌转移中的作用及机制。 方法：1．绘制本研究微流控肿瘤转移模型，并用相机拍摄微流控芯片实物图。 对模型的各个部分进行详细说明，对微流控芯片各个通道所加的成分进行解释。 2．从婴儿的脐带分离出MSCs，并进行MSCs的原代细胞培养，随后通过流式 细胞仪鉴定我们所培养的细胞是否是MSCs。 3．利用微流控芯片构建缺氧微环境肿瘤转移模型，把MSCs细胞种到微流控芯 片的通道中，分别放在正常的细胞培养箱