实验二 培养材料消时毒和接种.pptVIP

实验二 培养材料消毒和接种 一、实验目的 1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术 2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法 操作前的准备工作 接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗10-15 min.。 A: 实验器具和材料的准备B: 用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。C: 关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台） D: 用70－75％乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。 培养器材的清洗与灭菌 在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。 A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。 B、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。 清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗. C、金属用品洗涤  金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥 （1）干热灭菌适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃ 、40min （2）湿热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃ 维持20~30min （3）过滤灭菌 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素。 （4）射线灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机 、 （5）火焰灼烧灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。 二、实验原理 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟. 接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5 遍，最后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。 一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。 三、实验材料 器材： 超净工作台、镊子、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。 药品及材料： 0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基。 四、实验步骤 （1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。 （2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，照射至少20分钟，关闭台内的紫外灯，通风五分钟后，再开日光灯进行无菌操作。 （3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。 （4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。 （5）将种子放于广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。 （6）取出培养皿，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把皿表面擦一下。 （7）接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也