分子遗传标记技术.ppt

影响AFLP实验的因素 1 模板DNA 2 酶切效果 3 引物设计 4 PCR反应条件 25pg-250ng 、高纯度 关键步骤 一定G和C 、 （4n）2 预扩增、 选择性扩增 1.遗传多样性及系统进化中的研究 王志勇等对福建官井大黄鱼野生种群和2个养殖群体用5对选择性引物进行了AFLP分析,共检出503个不同扩增片断(50~450 bp),发现养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群,其遗传多样性水平较低,遗传变异贫乏。 2.亲缘关系鉴定 孙易等利用12对引物检测了15个种及品系的卤虫, 聚类分析结果表明,来自西藏的两性生殖卤虫为不同于中国内陆两性生殖卤虫的新种,内陆和沿海的孤雌生殖卤虫可能为不同的种。 AFLP技术在水产动物研究中的应用 3. 构建遗传图谱 Moore等利用AFLP多态位点构建了日本对虾的初步连锁图, 129个标记分布于44个连锁群,覆盖整个基因组的57%左右。 4.基因的定位及分离 Cui等运用cDNA-AFLP技术对红鳍东方鲀成熟和未成熟个体的逆转录DNA进行检测，发现了5个性别标记（TDF1-5）；其中前4个（TDF1-4）来自性腺，第5个（TDF5）来自尾鳍，因此，TDF5就可以用于快速鉴定红鳍东方纯性别，不必对鱼进行解剖。 4 SSR 微卫星（microsatellite），又称简单序列重复（simple sequence repeat, SSR） Moore Soolotterer 1991年共同提出，指含少数几个（1~6个）碱基对的短串联重复DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，每个微卫星DNA的核心序列结果相同，重复单位数10~60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 4.1 SSR标记技术原理 一般认为微卫星多态性产生的机制是DNA复制和修复过程中碱基滑动、错配或减数分裂中姐妹染色单体的不均等交换。 根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 微卫星主要以两个核苷酸为重复单元，如（GT)n, (GA)n,(CA)n,(TG)n (AT)n，也有一些重复单元为3核苷酸，少数为4个或更多。 不同遗传材料重复次数的可变性导致了SSR长度的高度变异。 微卫星的突变率在不同物种、同一物种不同位点和同一位点的不同等位基因之间存在很大差异。 检测单一的多等位基因位点，位点具有专化性。 微卫星呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律，可鉴别纯合子和杂合子。 SSR所需DNA量少，DNA降解也可有效分析。 SSR序列的两侧顺序常较保守，在同种而不同遗传型间多相同。 多数SSR无功能作用，在品种间具广泛的位点变异，比RFLP和RAPD分子标记具多态性。 4.2 SSR标记技术的特点 由于创建新SSR标记需要知道重复序列两端的序列信息，不能直接从DNA数据库查询，需要先对其进行测序。 研发初期困难，开始筛选重复序列和引物涉及过程较慢，费用较高；一旦引物确定，使用较方便结果也稳定。 缺点 4.3 SSR标记技术的操作 1）PCR扩增 通过相关文献、近源种引物、根据从研究类群基因组问库中筛选出SSR两翼序列设计引物或者专用数据库搜寻进行引物设计。 PCR反应 2）扩增产物检测 5~8%（质量浓度）变性聚丙烯酰胺序列胶或者高浓度琼脂糖凝胶上分离扩增产物。 3）统计分析 正常情况下，产生一条（纯合子）或两条（杂合子）带，弱带为假阳性条带。统计产生等位基因和基因频率的数据，可采用标准的群体遗传模式分析，多态比例或多态信息含量表示信息含量。 1.杂交优势预测中的应用 微卫星多态性反映着物种的进化历史。现代杂交优势理论认为，杂交优势大小在一定程度上取决于亲本间遗传距离的大小，因此，可以对群体或个体间遗传距离较远的物种进行杂交育种 2.群体的杂合度研究 水产养殖人工繁育计划的一个重要内容是要知道繁育群体的遗传变异的大小,从而制定出科学的管理措施,防止人工繁殖过程中进行遗传背景相似品系交配所造成遗传多样性的丢失。非科学的人工增殖常常造成子代杂和度降低和等位基因频率发生变化,特别是稀有等位基因的丢失。 SSR技术在水产动物研究中的应用 3. 家系分析 F.J.Garcia等用微卫星对一个科的狼鲈进行谱系分析表明:微卫星能够对种群间的界限和家系历史进行全面，准确的描述,能够比当前的所有的分子标记带来更多的信息。 4.遗传图谱的建立和基因定位 Thomas及其同事正准备利用罗非鱼遗传图谱中的62个微卫星标记鉴别不同品系罗非鱼的数量性状位点,用于培育品质更优良的品种。 5.进化研究 6.DNA指纹图的制作 水产生物常用分子标记 RFLP, RAPD,AFLP SSR, ISSR, SNP 线粒体、叶绿体