免疫组点化实验课.ppt

免疫组化原理 抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。 对照染色的目的 假阴性的原因主要有： ①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽； ②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）； ③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有： ①自发荧光或内源酶等干扰； ②抗体试剂不纯(特别是一抗）； ③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等； 对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类： 对照的种类及其选用目的 阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。 对照的种类及其选用目的 阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。 对照的种类及其选用目的 空白对照 指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。 对照的种类及其选用目的 取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。 吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。 对照的种类及其选用目的 ①空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂； ②对照必需与实验片同步进行染色； ③对照的结果应附合要求。 阴性试剂对照的选用原则 免疫组化实验步骤 实验四 免疫组化结果采集与分析技术（4学时） 实验内容： 1 阳性信号的判断 2 免疫组化结果拍照 3 结果分析 免疫组化结果的判断原则： ⒈必须同时设对照染色。 没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。 如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。 免疫组化结果的判断 ⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 ⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。 免疫组化结果的判断 免疫组织化学实验课计划 赵坤庆 赵清杰 中国科学院动物研究所 Email：zhaokq@ioz.ac.cn zhaoqingjie11@mails.gucas.ac.cn 实验一 实验动物取样、固定与保存（4学时） 实验室规章制度及实验室安全讲解 学生分组 分小组配置相关溶液：操作 动物的致死法及取材: 操作 细胞标本的制备：操作 尸体解剖的取材：讲解 活检标本的取材：讲解 组织样品的固定：操作 实验室规章制度及实验室安全 ⑴ 熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。 ⑵ 检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。 ⑶ 工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。 ⑷ 不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。 ⑸ 必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。 ⑹ 熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。 ⑺ 保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。 ⑻ 实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。 ⑼ 离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。 ⑽ 遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。 ⑾ 保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。 ⑿ 做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法”执行。 ⒀ 及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。 ⒁ 实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使