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———————————————————————————————— 厦门大学生物医学仪器共享平台 网址： HYPERLINK 97 97 电邮：bio-center@ 地址：福建省厦门市厦门大学翔安校区黄朝阳楼D102 电话/传真：0592-2186630 邮编：361002 注意事项及填写说明（送样前必读） 如果阅读完以下说明仍然不知道如何准备样品，请到生命科学学院黄朝阳楼D102咨询或者打电话（谢昌传吴雅颖；AB Sciex TripleTOF 5600和5600+只接受蛋白样品委托做样。 主要提供以下技术服务：1. 蛋白质测序: 样品含量较高或纯度较高时，通过谱图得到肽段的序列，进而得到整个蛋白的准确序列，可用于辅助判断不稳定蛋白的氨基酸断开位置。2. 蛋白质定性分析: 用于鉴定未知蛋白或得到与已知蛋白相互作用的未知蛋白。3. 蛋白质定量分析: 采用标记定量（SILIC，iTRAQ、TMT）或非标记定量（Label free,SWATH），分析某组织或细胞的蛋白表达差异。4. 蛋白质翻译后修饰位点鉴定分析，如：磷酸化、泛素化、乙酰化、N-糖基化、硫化修饰和甲基化等（如果要鉴定其它蛋白质翻译后修饰，务必先与老师联系是否能做）。5. 提供蛋白质酶解、肽段抽提及脱盐、样品上机和数据分析服务。 样品准备好后，请登录生物医学仪器共享平台（http:// 97/），点击“质谱-蛋白质组”，找到“液质联用仪 AB Sciex TripleTOF 5600+”，点击“送样预约”，根据预约要求选择正确的“计费规则”（?1.简单样品：只切一个条带或一个点的考染或者银染样品，样品胶体积不超过300uL；只含单一蛋白的溶液样品；IP跑SDS胶后，泳道分成多个组分的（胶体积小于300uL/样品）。 2.复杂样品： (1)IP后的粉末样品或者溶液样品；（2）不需要进一步分组分的组织、细胞蛋白提取样品。 3.如果需要进一步分组份的样品，要先与管理仪器的老师联系如何选择计费规则）。如果不清楚需要选择哪一个“计费规则”，请先到D102室咨询。预约后两小时之内，把样品和填写好的“检测申请单”一起送至黄朝阳楼D102。 样品不能含有SDS、TritonX-100、NP-40、PEG、Tween-20、甘油和CHAPS等去污剂（会抑制目的蛋白的信号）；只收用Tripsin酶解的样品，如需用其它蛋白酶进行酶解需先来询问是否可以使用该酶，所用的蛋白酶需要自行准备。 所送样品所属的蛋白库要在能搜索到，或者自己提供正确格式的蛋白库文件。 胶样品（SDS）： 要求 胶切成1.5 mm X 1.5 mm大小的块状，放入1.5 mL 离心管内，可以不脱色，保存在1 mL纯水中，或者用乙腈脱色液脱色后保存在乙腈脱色液中；单个样品胶体积不能超过300 ?L； 制样注意事项 准备样品过程中要注意减少角蛋白污染，所用器具要求极干净。 样品尽可能跑在一条泳道内，如果样品体积太大无法跑在一条泳道中最好进行浓缩处理，以提高单位体积内蛋白含量。样品跑入分离胶的长度需要根据实验目的来定，溴酚蓝最少要进分离胶1 cm。建议如非必要胶的浓度最好不要 10%，影响酶解效率。 不建议银染；或银染时，敏化不加戊二醛，染色时不加甲醛，显色时才加（戊二醛会造成蛋白交联，影响酶解） 考染样品控制染色时间，不宜染色太深（看得到条带即可），然后用脱色液脱色至能看清泳道或者目的条带即可；然后，用超纯水把脱色液清洗干净，把胶置于超纯水中浸泡至胶膨胀到为染色时的大小，即可进行切胶。（染色液，脱色液需要新鲜配制，所用器皿要求极干净） 在通风橱切胶，切胶时请带上口罩，女生绑好头发，采用干净的手套和一次性刀片； 为减少样品损失，切胶时请务必去掉非目的条带部分，尽量减少样品体积，建议每管样品胶体积小于300ul； 切胶时请尽量避免条带间的交叉污染；把胶切成约1.5 mm X 1.5 mm尺寸的小块放于进口1.5 mL 离心管内（每管内胶体积≦300 uL），然后用超纯水（ddw）洗三遍以上，随后用脱色液【40% 乙腈（ACN），50 mM碳酸氢铵（ABC）in H2O】脱至无色，样品最后保存在乙腈脱色液中。 请务必根据marker估计每个样品的蛋白量（多少ug或ng），否则不受理该申请单（无法进行酶解处理）； IP样品： 样品以溶液方式送样（必须注明样品体积uL）：A.如果从细胞裂解液中IP，裂解细胞前用PBS清洗细胞三次，以除去细胞培养液中残留的BSA， IP后beads必须用1 mL PBS洗3次以上，置于旋转混匀器上转10 min/次（去除样品中残留的SDS，TritonX-100