放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法.ppt

放射性配体与受体结合分析实验（RBA）方法 刘星华 2011-5-13 内容 实验定义与原理 实验材料与仪器 实验方法 Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） RBA的安全问题 实验举例 实验定义与原理 定义 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of receptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。 RBA的分类 RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。 实验材料与仪器 实验材料 动物组织（皮层、海马、纹状体等） 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等） 实验仪器 组织匀浆机 IKA，T10B S25 漩涡混合器 WH-2 低温高速离心机 凯达，TGL20M 超低温冰箱 海尔 数显恒温水浴锅 金燕，HH-S26S 制冰机 GELIN 型号IMS-50 automatic ice flakes 电热恒温水温箱 循环水式多用真空泵 液闪测定计数仪 HIDEX， 425-034型 实验材料 2ml离心管 6ml一次性软试管 枪头 Tris PPO与POPOP 过滤装置 砂芯过滤装置（抽滤瓶） 1000ml Whatman GF/C玻璃微纤维滤纸 40mm 放射性化合物 放射性配体 低温保存 实验方法流程 实验方法流程 1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。 实验具体操作（D1、D2、5-HT） 1、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、Butaclamol及5HT 等 2、制备膜受体 大鼠断头取脑 分离出目标组织 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机 试剂：超纯水 3、加样 取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。 取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。 （1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 4、 受体配体结合反应 以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无 5 、分离游离及结合的放射性配体 上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器