染色体分析相关的实验.docVIP

第三章 染色体分析相关的实验 目前染色体的研究几乎深入到每个学科的每一个领域，因为染色体是把细胞与分子联系起来的重要桥梁，故在遗传学研究中或者在医学研究中被广泛重视及应用。近几年相继出现了脆性位点、热点、重排与癌基因激活及抑癌基因丢失，癌基因定位、抑癌基因定位及杂合位点缺失等与染色体相关的理论；另一方面与染色体畸变有关的各类遗传病的研究也使临床上染色体的分析上了一个新的台阶。 染色体分析相对较简单，细胞通常采用循环血中的淋巴细胞，胎儿采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。细胞经过培养，再用植物凝集素（PHA）刺激细胞分化。当每个染色体都复制成两个染色体单体时，随后加入秋水仙素，在分裂中期阻止细胞有丝分裂。位于载玻片上的细胞随后被染色，在显微镜下拍照或用计算机进行图像分析。根据染色体形态大小,剪下照片上的染色体，按序分类排贴在纸上,进行核型分析。 染色体显带通常通过G显带或Q（荧光）显带染色技术进行，增加其他染色方法可提高细胞遗传学诊断的准确性。 新的分子生物学技术使用DNA探针(含有荧光标记)来定位染色体上特定基因和DNA序列，荧光素标记的原位杂交技术可用于鉴别基因结构和寻找染色体缺失，重排及复制。 实验3-1 人类染色体标本的制备 一、实验目的 掌握人类外周血细胞培养方法及染色体标本的制备方法。观察人类染色体的形态和数目。 二、实验原理 血液中的T淋巴细胞在体外培养中经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼进行细胞分裂，用秋水仙素积累分裂相，用0.075 mol/L-1KCI进行低渗后，经固定、染色，可见到分散的染色体。 三、实验准备 超净工作台、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、离心机、定时钟、试管架、量筒、刻度离心管、冰凉玻片，毛细滴管、恒温水浴锅、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为3∶1，现用现配）、0.075mol。L-1KCI低渗液、Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、恒温培养箱、吹风机、粗天平、5％NaHCO3、显微镜。 四、实验方法与步骤 （一）接种 取500单位/lml的肝素0。2ml湿润针筒后，取静脉血1～2ml，转动针筒以混匀肝素；随后立即插入灭菌小瓶内，送入超净工作台（消毒、灭菌等略），在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液（4ml RPMIl640、lml小牛血清，5mg PHA，用5％的NaHCO3调pH至7.0～7.4）的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（7号针头13滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。 （二）培养 1．将培养瓶放在37℃恒温箱内培养72h。 2．在终止培养前2～4h，将0.01％的秋水仙素1～2滴（7号针头）加入培养瓶内，轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养2～4h。 （三）收获 1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入刻度离心管内，相对离心管平衡后放入离心机，离心8min（1000转/分），吸去上清液，留下沉淀物。 2．低渗处理：加8ml预温（370C）的0.075mol。L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬 浮于低渗液中，放回37℃恒温水浴锅中，静置15～20min，使白细胞膨胀，染色体分散、 红细胞解体。 3．预固定：加入固定液1～2ml打匀。 4．再离心：1000转/分离心8min，吸去上清液，留下沉淀物。 5．固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀，固定30min。 6．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液，留下沉淀物。 7．再固定：再加入新配固定液8ml，打匀，静置30min。 8．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液。 9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打匀成细胞悬液。 10．制片：用滴管吸细胞悬液2～3滴，滴在冰水预浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，在酒精灯上过几次，吹风机吹干或气干。 11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸缓冲液为1∶9）染色10 min～20min、自来水冲洗、晾干。 （四）镜检 低倍镜下找到分散良好的分裂相后，换高倍镜、油镜、认真观察。 （五）注意事项 1．PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。 2．浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。 3．秋水仙素溶液浓度和处理时间。一般最终浓度每毫升培养液0.1～0.2μg为宜，作用时间为3～5h，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系。如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊。 4．培养温度应严格控制