常用液相色谱柱原理..pptVIP

用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱体积→再用 THF（四氢呋喃）以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速冲洗约10倍柱体积→保持95%乙腈-5%水继续冲洗，以低流速0.2～0.5mL/min冲洗过夜→流动相平衡2h（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水-有机相以1.0ml/min流速冲洗约30min），进样检测即可。 3.3阴/阳离子交换柱（negion/cation exchange column） 3.3.1阳离子交换柱常见故障与处理：离子交换柱属于较脆弱的色谱柱，阳离子交换柱在使用过程中，往往会由于不规范操作而导致一系列故障。常见故障如下： ①柱压升高伴随柱效降低：主要是由于系统管路或柱保存过程中柱内或长菌、样品溶液中的颗粒物积聚在烧结物或者柱床上等所致。 ②色谱峰额外地展宽：主要是由于管路太长、非新鲜配制的流 动相中含有不正确的阴离子、流动相pH与离子强度不正确、用流动相平衡时间不够等所致。 ③柱压正常伴随柱效降低：主要是由于样品中有脂肪，油脂，脂质等有机物致使固定相的表面被覆盖、从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备洗脱液、在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物（eg.运输时从大气中带来）。 针对上述情况，在使用离子交换柱过程中需特别注意即可避免。若已经产生故障，可根据实际情况处理，尝试按如下方法再生： 首先反接色谱柱→用1mol/L的硝酸铵溶液，以0.4ml/min的流速洗脱30ml～60ml→再用甲醇-水（40：60），以0.4ml/min的流速洗脱30ml～60ml→然后用异丙醇，以0.4ml/min的流速洗脱30ml→再用去离子水，以0.4ml/min的流速洗脱30ml→然后用检测用洗脱液，以0.4ml/min的流速洗脱30ml→最后将柱子接回正常方向，用检测用洗脱液平衡至基线平稳，进样检测即可。 3.3.2阴离子交换柱常见故障与处理：同阳离子交换柱。不同的是，阴离子交换柱在不正确的较低pH条件下会导致系统峰（溶剂峰+硫酸盐峰）逐渐前移和峰向（正与负）针针变化。处理：正确配制新鲜的pH在3.8-4.3之间的洗脱液。 若出现与阳离子交换柱相同的常见故障，处理方法同阳离子交换柱。 3.3.3部分离子交换柱要求不同，可采用0.05mol/L的硫酸溶液（阳离子交换柱）或0.05mol/L的氨水溶液（阴离子交换柱），反向连接色谱柱，以0.3ml/min流速过夜冲洗→换成去离子水，以0.5ml/min流速，冲洗约12h→再正向连接色谱柱，用流动相平衡至基线稳定（若流动相中含有缓冲盐，需先用超纯水以0.5ml/min流速冲洗约10倍柱体积，再进行平衡），进样测试即可。 3.4手性柱（Chiral HPLC Column） 手性色谱柱在使用过程中往往会由于操作不当而导致一系列问题，现以AGP柱为例加以说明和规范。 （1）常见故障原因及处理办法： ①手性异构体无法完全分离：多为色谱条件不妥，需要重新考察色谱条件。 ②峰形变差，诸如拖尾、分叉、前延：多为色谱柱污染、柱床硅胶溶解与柱头塌陷（往往是由于流动相pH超过8.0或流速及柱温选择不当导致）、柱床干涸等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。 ③柱压升高到100bar以上：多为色谱柱污染、柱头塌陷等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。 （2）再生补救措施： 手性柱若用时过久，在保证色谱条件正确与操作得当的情况下，若出现上述故障，可尝试按如下程序再生： 清洗筛板、更换柱头硅胶→反接色谱柱，用纯水以0.2ml/min流速冲洗约4h→用25%异丙醇溶液以0.2ml/min流速冲洗过夜→再顺接色谱柱，用纯水以0.2ml/min流速冲洗约6h→再用25%异丙醇溶液以0.2ml/min流速冲洗约1h→然后用纯水以0.5ml/min流速冲洗约2h→再用流动相平衡约2h（若流动相中含有缓冲盐，需先用水-有机相，按流动相同比例同流速冲洗约30min），进样检测即可。[备注：手性柱价格昂贵，而再生结果多具有较大不确定性，要么成功要么报废，因此，请谨慎进行手性柱的再生!] （3）备注：部分品牌手性柱（eg.YMC CHIRAL NEV手性柱）用纯乙腈保存，通常在反相条件下使用。当出现柱压增高、分离度降低与峰形变差时，需要进行必要的处理。 1）若为柱头污染，清洗程序如下：反接色谱柱，不接检测器，用流动相冲洗约20倍柱体积→用纯水冲洗约20倍柱体积→正接色谱柱，接或不接检测器，用纯水冲洗约20倍柱体积→接检测器，用流动相平衡至基线平稳，进样测试；若不能解决问题，则需要拆卸筛板清洁（程序同反相柱），必要时更换筛板。 2）若为强保留物质污染，清