血清球蛋名白的分离纯化与鉴定.pptVIP

实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 层 析 技 术 2. 依据：混合物中各组分的理化性质差异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数。 固定相—固定不动流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。 4．分类：①流动相的物理状态：气相和液相→ 气液/固，液固/液②方式：纸、薄层、柱③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相 5．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 ②基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。流动相：洗脱液 凝胶层析的基本原理 共性：*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同 影响因素：①温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。②pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。③蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。 ②凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。 注意事项：1．硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入2．流洗柱子：3～4个柱长3．上样：转圈滴加，起跑线一致4．防止柱上液层干涸5．洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高0.5ml7. 用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。 ④鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。 醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液 【操作步骤】1．点样：取经巴比妥缓冲液浸透的2×8cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置5～10分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2．通电：接通电源，调节电压为40～50V，通电2 ～ 2.5h，关闭电源，停止电泳。3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。 实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 清蛋白 pI=4.9 57%～72% α1 2%～5% α2 pI6 4%～9% β 6.5%～12% γ pI=7.3 2%～20% 球蛋白 ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 清蛋白（albumin，A）：38～48g/L 球蛋白（globulin，G）：15～30g/L A/G：正常值1.5～2.5 ? ? ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 加样线 加样线 纯化蛋白 对照 样品 5）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用 * * 层析技术 实验原理 实验思路 实验流程及操作注意事项 1．层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术. 3．基本原理：固定相和流动