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液相色谱基础知识 2017年04月11日 一、什么是色谱 色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 常见的分离方法： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤、等等。 色谱法的发明人： 俄国科学家： 麦克海尔.塞蒙诺维奇.维茨特 M. S. Tswett 二、什么是液相色谱呢 液相色谱：流动相是液相 液相色谱 柱色谱 纸色谱 HPLC 薄层色谱 三、什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段。 具有高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。 HPLC的分离原理、仪器配制和工作流程 分离原理 动画演示 溶剂 色谱泵 进样器 HPLC色谱柱 检测器 废液 数据处理系统 请单击 请单击 请单击 请单击 请单击 四、高效液相色谱法的特点 “三高一广一快” ： ①高压：对载液加高,流动相能迅速通过色谱柱压. ②高效：分离效能高。 ③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。 ④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析。 ⑤分析速度快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15—30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 1、液-液分配色谱 2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱 4、离子对色谱 5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC) 1、液-液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C18柱（反相柱）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。 反相高效液相色谱法 即指流动相的极性大于固定相极性的色谱方法。 在本法中常采用化学键合相作为固定相，流动相采用水—甲醇或水—乙腈系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此适合于共存组分极性差异较大的样品分析。 乙腈(jīng) 乙腈又名甲基氰，分子式CH3CN，无色透明液体，密度小于水，约为0.79，能与水和乙醇等有机溶剂以任意比混溶，易燃，有毒性。 2、液-固吸附色谱 基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸 固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾 六、色谱柱 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10μm的范围内.另一类正相填料是硅胶表面键合-CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的(C18)非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。 1. 色谱柱的选择 2. 本公司使用的柱子 主要特点: 使用过程中柱压稳定，即使长时间使用也不会出现拖尾等异常情况 使用寿命长，清洗频度低，仅为同类产品的15% 七、样品的前处理 a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与 柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂 质。 d、利用超声仪脱气。 八、流动相的配制 a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中?。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应。 c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效 果；同时降低柱压，延长液体泵的使用寿命 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡。 f、在流动相配制好后，使用0.45 μm滤膜过滤，并进行脱气。 九、流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对内径为4.6mm