四基因工程操作过程.pptxVIP

Genetic Engineering1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术4 基因工程的操作过程A重组体的构建（切、接）B重组体导入受体细胞（转、增）C重组体的筛选和鉴定（检）切接转增目的蛋白检载体DNA外源DNA连接 重组分子电穿孔或显微注射转化或转导 真核细胞原核细胞（受体细胞） 扩增或表达 表达A重组体的构建 粘性末端的连接 平末端的连接 PCR产物的连接 DNA体外连接应注意的事项 载体和外源DNA插入片段的连接结果一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。1. 两段DNA的连接依靠粘性末端2. DNA片断与载体的连接1）同种酶产生的粘末端连接－插入 正反向插入 载体、外源基因自我连接 载体和外源基因混连ligasenick2）定向连接－置换用产生不同粘末端的两种限制性酶消化载体与外源DNA 避免了载体和插入分子自我连接 以固定方向重组 有些载体的粘末端形成少量碱基互补，形成开环二、平末端（blunt end）的连接1. 直接连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%－10 % 。5’ 5’ P--OH3’ P--OH3’ HO-HO--P3’ -P3’ 5’ 5’ 5’ P--OH3’ -PHO-3’ 5’ 2. 获得平末端的方式（1）用产生平末端的内切酶切割 载体和外源DNA5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’PvuII 37 ℃5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’（2）用Klenow聚合酶补平或S1核酸酶切平获得 Klenow酶拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性 S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA3. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。①原理：DNA末端转移酶(TdT)能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。②平末端变为3’突出末端用5 ’特异核酸外切酶或能产生3 ’突出末端的内切酶消化。③加尾—碱基互补分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。③优点：能把任何片段连接起来，且避免载体和外源DNA自身环化④缺点：不能把插入片段再切下来。非酶切位点（2）衔接物(linker)连接① linker用化学合成法合成的一段10-12bp的具特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：② linker的作用用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 ③优点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。2）能给载体连接上Polylinker④缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段。（3）DNA接头 (adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。① adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter② adapter的作用用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。P-5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ -PBlunt-ended DNABamHI adapterT4DNA连接酶5‘p-GATCCCGG- GGCC--CCGG -GGCCCTAG-P5’ CCGG GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGG- GGCC-接头自我连接CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’ ③优点：连上后就能用。④缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。⑤防止自我连接先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。） P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-PCIP处理 5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’ 5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’ -OH CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’ HO-接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ BamHI adap