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第六节 载体系统 一、质粒载体 （一）质粒的一般生物学特性 （二）基因工程中质粒载体的构建 （三）pBR322质粒载体 （四）pUC质粒载体 （五）质粒载体的稳定性问题 （一）质粒的一般生物学特性 1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb以上不等。 2 细菌质粒的一般生物学特性： 1）很多细菌中已发现； 2）是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； 3）大多数质粒的宿主范围较窄； 4）已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 5）复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质； 6）常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。 3 质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 4 质粒给宿主细胞的标记 (1) 氨苄青霉素 (Ampicillin ) (2) 卡那霉素 (Kanamycin) (3) 四环素（Tetracycline） (4) 氯霉素(Chloramphenicol) (5) 链霉素（Streptomycin） (6）潮霉素（Hygromycin ） 5 质粒的复制类型 据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： （1）“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷贝数少 ； （2）“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷贝数多。 6 质粒DNA的转移 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid) 非接合型（non-conjugative plasmid) (2) F质粒(fertility factor) F+ 又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应的 F– 又叫雌性细胞。 F质粒(94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式： ① F+ ② F` ③ Hfr。 7 质粒的转化 （二）基因工程中的质粒载体 克隆载体必备条件 表达载体的必备条件 (1)能自主复制 (2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记 (3)具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控 (5)具有强终止子 (6)具有翻译起始信号 2 质粒载体的选择标记 （三）pBR322质粒载体 （四）pUC质粒载体 ?具更小的分子质量(2.69kb)和更 高的拷贝数?适于组织化学方法检测重组体?具多克隆位点MCS区段 其它重要的质粒载体 （五）质粒载体的稳定性问题 二、噬菌体载体 1 噬菌体的结构及其核酸类型 2 噬菌体的生命周期 t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒 （2）温和噬菌体 3 λ噬菌体载体 （1）λ噬菌体的分子生物学概述 （2）λ噬菌体载体 （2） λ噬菌体载体 λ噬菌体载体可分为： 插入型载体 替换型载体 4 M13噬菌体载体 6.4 kb单链环状正链DNA基因组。 作载体的优点： (1) RF DNA 和SS DNA都可感染E.coli，产生噬菌斑； (2) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； (3) 复制以双链环形DNA为中间媒介； (4）易测出外源DNA的插入方向； (5）可产生能直接测序的单链DNA分子。 三、 cosmid克隆载体 cosmid（cos site-carring plasmid） 人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 柯斯质粒载体的特点： 1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基