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第二章 DNA重组 不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程。 第二节 限制性核酸内切酶 和DNA片段化 4、限制酶的命名 5、类型 Ⅰ型限制酶 Ⅱ型限制酶 Ⅲ型限制酶 （2）Ⅱ型限制酶（十分有用） 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。 二、Ⅱ型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列 限制酶切割位点——DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用↓或/表示。 如：G ↓ GATCC、AT ↓ CGAT等； 少数位点在识别序列两侧，如： ↓GATC、CATG ↓ 5、某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变 Star活性：又称星活性，在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称为Star活性（限制酶的第二活性）。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“☆”，如EcoR Ⅰ★。 反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。 1、底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。 DNA纯度； DNA分子构型；（线形DNA超螺旋和环形DNA） 识别序列的侧面序列； 位点偏爱； DNA甲基化。 2、限制性核酸内切酶用量 主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 1酶活性单位（unit或U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1μg λDNA所需的酶活性。 酶活性高的用量少，反之则多。 能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。 等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。 3、限制性核酸内切酶反应缓冲液 包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。 4、限制性核酸内切酶反应温度 大多数的最适反应温度是37℃，而少数酶的最适反应温度高于或低于37℃。 四、DNA分子片段化 天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶切和部分酶切等方法。 单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常用。 双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。 部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 五、DNA分子的限制性图谱 限制酶图谱（restriction map）:描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。 第三节 特异性DNA片段的PCR扩增 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction） 即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年发明，又称基因的体外扩增法。也有人称无细胞分子克隆法。 PCR技术的用途 目的基因的扩增与分离； 医疗诊断； 基因突变与检测； 分子进化研究； 环境检测； 法医鉴定。 一、基本原理 二、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 2、靶 DNA 和模板 靶 DNA：待扩增的特定DNA双链片段。应该知道其两端20～30bp的核苷酸序列，供设计一对引物之用。 模板：一条单链的DNA片段 3、PCR引物 PCR扩增引物：是指与待扩增DNA区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。它包括引物1和引物2。 引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。 具体的设计原则： 引物3’端必须具有游离-OH基团； 引物长度20-30个核苷酸，G+C含量一般为40%~60%，四种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在； 引物应避免回文结构，同时引物之间也不能有互补性 ，避免形成引物二聚体； 5’端可以修饰，如加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。 扩增编码区域时，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率 ； 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源 4、PCR原材料 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 或修饰过的核苷酸 5、PCR缓冲液 140mM Tris-Hcl（pH8.8）、 4 ～8mM MgCl2、 40mM