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思考题 金免疫法能测出抗体，如 此简单、方便如何用荧光 免疫能检测出吗？，下一 次课学习荧光免疫检测， 预习相关内容 操作步骤： 在进行任何测试前必须先完整阅读使用说明书，使用前将诊断试剂和全血/血清/血浆标本恢复至室温。从原包装铝箔袋中取出诊断试剂(注意:在打开铝箔袋前应先恢复至室温)。在1小时内应尽快地使用，特别是在室温高于30℃或是在高度潮湿的环境中应尽快使用。 1. 将诊断试剂置于干净平坦的台面，用一次性塑料吸管吸取全血/血清/血浆标本，垂直加入1滴全血/血清/血浆标本(约25μl)于加样孔(S)中，然后滴入1滴缓冲液于加样孔(S)中。 2. 等待红色条带的出现,在15分钟时读取测试结果,在20分钟后读取的结果无效。 　 任务九 金免疫标记技术 知识目标 技能目标 素质目标 1.掌握金免疫标记技术原理和分类 2.了解标记物的制备 3.了解金免疫检测的临床应用 1.会金免疫标记物的制备操作 2.会熟练操作金免疫检测过程 树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。 任务目标 任务对象 肺炎支原体抗体检测 　 任务过程 复习提问 案例导入 讲解与示教 学生操作 讨论分析 评价、考核 课后思考题 教 学 环 节 2′ 30′ 2′ 10′ 40′ 5′ 1′ 患儿，女，11岁，间断发热1周，伴咳嗽3天。体温最高39。1度，病程第2天查血常规正常，诊断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快速诊断？ 案例导入 斑点金免疫层析法演示 肺炎支原体诊断试剂盒 讲解与示教 二用采血针采指尖血 一洗净双手 四立即加1-2滴缓冲液 三将1滴指尖血滴入加 样孔 操作 步骤5：15分钟读 取结果 ？？结果 ？？结果 老师纠正 点评 学生操作 一位学生 操作演示 学生分组 再操作 讨论分析 提出问题 为什么在小小的 试纸条上出现两条 红线就是阳性结果 ，如此简单、方便 的方法可靠吗？ 有假阳性或假 阴性的可能吗？ 如何检测出来 的，原理是什么？ 胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。 讨论分析 胶体金标记技术 讨论分析 （一）金免疫检测原理 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 讨论分析 Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色。 Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术 胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金／银染色及斑点金免疫渗滤测定法等多种标记免疫检测方法 1971年 1978年 近年来 讨论分析 讨论分析 枸橼酸三钠还原法 鞣酸—枸橼酸钠还原法 根据不同 的还原剂 可以制备 大小不同 的胶体金 颗粒。常 用来制备 胶体金颗 粒的方法 胶体金的制备 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。 （2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混匀即可。 （3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm 讨论分析 2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 A液：1％HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液：1％枸